MP-PCR^[59]

میر و همکاران ۱۹۹۳

۲

تکثیر بین ردیف‌های تکرار ساده
واکنش تکثیر تک آغازگر

ISSR

زیتکی ویز وهمکاران۱۹۹۴

۳

SPAR^[60]

گوپتا و همکاران۱۹۹۴

۴

چند شکلی ریزماهواره تکثیر شونده تصادفی

RAMP_S^[61]

یو و همکاران ۱۹۹۴

۵

ریزماهوارره تکثیر شده تصادفی

RAMS^[62]

هان تولا و همکاران ۱۹۹۶

۶

پی سی آر آغازگرهای ریزماهواره ای قلاب شده

AMP-PCR^[63]

ویسینگ و همکاران ۱۹۹۸

۷

ردیف‌های تکراری ساده قلاب شده

ASSR^[64]

وانگ و همکاران ۱۹۹۸

(ردی و همکاران، ۲۰۰۲)
۲-۱۴-۲ منشا تغییرات چندشکلی در نشانگر ISSR
آهنگ تکامل تغییر در ریزماهواره‌ها، به طور قابل توجهی در مقایسه با دیگر انواعDNA ، بیشتر است. بنابراین احتمال چندشکلی در این توالی‌ها، بیشتر است. منبع(منشاء) چندشکلی در ISSRS می‌تواند به هر یک از دلایل زیر ترکیبی از عوامل زیر باشد.

DNA الگو: سرخوردن DNA پلیمراز در طی مدت همانندسازی و اشتباه در تغییر جفت‌شدگی‌های به عنوان یکی از مکانیز‌های ایجاد تنوع می‌باشد. جهش در جایگاه اتصال( مانند نواحی مایکروساتلایت) می‌توان یکی از دلایل ایجاد چندشکل باشد. حذف‌شدگی و یا اضافه شدن درون ناحیه میکروساتلایتی یا ناحیه تکثیری باعث عدم حضور یک محصول یا تغییر در اندازه محصول خواهد شد و این می‌تواند باعث ایجاد چندشکلی شود. همچنین تغییر در تعداد تکرار نوکلئوتیدها در یک ریزماهواره، وقتی که از یک آغازگر قلاب شده به انتهای ׳۵ استفاده شود منجر به چندشکلی طولی خواهد شد(ردی و همکاران، ۲۰۰۲).
نوع آغازگر استفاده شده: میزان چندشکلی با نوع آغازگر(غیر قلاب شده به ʹ۳ یا ׳۵) و توالی تکرارهای( موتیف‌های) استفاده شده در آغازگر تغییر می‌کند و زمانی که از آغازگر قلاب نشده استفاده می‌شود به عبارت دیگر فقط SSRها به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار گیرند، آغازگر تمایل به سرخوردن درون واحدهای تکراری در طی تکثیر دارد. بنابراین ممکن است بجای باندهای واضح، تعداد زیادی باند اسمیر^[۶۵] تولید شوند) شکل ۲-۳ الف). دنباله‌دار کردن یک آغازگر با یک الی چهار نوکلئوتید در انتهای ʹ۳ (شکل ۴-۲ب). یا ׳۵ (شکل ۲-۴ج) باعث می‌گردد که اتصال آغازگر فقط در دو انتهای یک میکروساتلیت در DNA الگو صورت پذیرد، بنابراین از اتصال درونی و تشکیل باندهای متعدد(اسمیر) جلوگیری می‌کند. از طرف دیگر ناحیه قلاب شده اجازه می‌دهد که فقط یک زیر مجموعه از میکروساتلایت به عنوان جایگاه اتصال به کار روند. از آنجا که آغازگر در این روش یک موتیف ساتلایتی است، فراوانی توزیع موتیف‌ها در گونه‌های مختلف نیز در باندهای تولید شده تاثیر دارد. بین توالی‌های DNA و اندامک‌ها و هسته‌ای، از لحاظ فراوانی و مقدار SSRها تفاوت وجود دارد. با در نظر گرفتن توالی دو نوکلئوتیدی و سه نوکئوتیدی با یکدیگر، در هر kb 33 در DNA هسته‌ای یک SSR یافت می‌شود. در مجموع آغازگرهای مورد استفاده در ISSR بر اساس موتیف‌های دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی هستند که امکان تکثیر گسترده‌ای از محصولات را فراهم می‌کند(گوپتا و همکاران، ۱۹۹۹). اگر چه معمولا در انتهای ʹ۳ یا ׳۵ خود به یک تا چهار باز متصل بوده و براساس آنها، گسترش می‌یابند (شکل۲). با بکارگیری پرایمرهای دو و سه نوکلئوتیدی با یکدیگر، یک SSR در هر ۳۳Kb توالی DNA هسته، در مقایسه با هر ۴۲۳Kbاز توالی DNA اندامک، یافت شد. بطور کلی، آغازگرهایی با تکرارهای (AG), (GA), (CT), (TC), (AC), (CA) چندشکلی بیشتری نسبت به آغازگرهایی با دیگر تکرارهای دو یا سه نوکلئوتیدی نشان می‌دهند. تکرارهای (AT) فراوانترین دو نوکلئوتیدها در گیاهان هستند اگر چه آغازگرهایی مبتنی بر(AT)، خوداتصال بوده و DNA را تکثیر نمی‌کنند(ردی و همکاران، ۲۰۰۲). تکرارهای دو نوکلئوتیدی قلاب شده(به انتهای ʹ۳ یا به انتهای ׳۵) چندشکلی بالایی را آشکار می‌سازد(بلایر و همکاران، ۱۹۹۹).
آغازگرهای قلاب شده در انتهای ʹ۳ شکل ۲-۲ ب در مقایسه با آنهایی که به انتهای ׳۵ وصل شده‌اند شکل ج الگوی باندی واضح‌تر را نشان می‌دهند(بلایر و همکاران، ۱۹۹۹ و تسومارا و همکاران^[۶۶]، ۱۹۹۶). معمولا آغارگرهای با تکرارهای سه و چهار نوکلئوتیدی کمترین فراونی را داشته و استفاده از آنها در ISSRs کمتر از پرایمرهای با تکرارهای دو نوکلئوتیدی است. (AG) و پرایمرهای مبتنی بر آن، باندهای شفافی در برنج(جویشی و همکاران، ۲۰۰۰)، پرتقال سه برگی(فانگ و همکاران، ۱۹۹۷) و نخود تکثیر کرده‌اند، در حالیکه آغازگرهایی مبتنی بر تکرارهای دو نوکلئوتیدی(AC)، در گندم و سیب زمینی مفیدتر دانسته شدند(ردی و همکاران،۲۰۰۲ و بلایر و همکاران، ۱۹۹۹).
۲-۱۴-۳ روش تشخیص نشانگر ISSR
میزان چندشکلی شناسایی شده بسته به نوع روش شناسایی، متفاوت است. الکتروفورز ژل پلی‌اکریلآمید (PAGE) در ترکیب با نوکلئوتید رادیو اکتیویته(نوکلئوتید لیبل گذاری شده در واکنشPCR)، و متعاقب آن رنگ آمیزی با نیترات نقره، حساس‌ترین سیستم شناسایی بوده و پس از آن سیستم آگارز-اتیدیوم بروماید حساس‌ترین است. وقتی ژل پلی‌اکریلآمید استفاده شد، نسبت به ژل آگارز، باندهای مشخصا بیشتری به ازای هر پرایمرحاصل شد(مورنو^[۶۷] و همکاران، ۱۹۹۸). در یک مطالعه بر ژرم‌پلاسم پرتقال سه برگی، رنگ آمیزی نیترات نقره با بهره گرفتن از مواد شیمیایی با کیفیت بالا توانست همه باندهای شناسایی شده توسط اتورادیوگرافی را شناسایی کند(فانگ و همکاران، ۱۹۹۷). اما سطوح بالای چندشکلی ISSR، حتی وقتی محصولات تکثیر، بدون لیبل گذاری با مواد رادیواکتیو بر ژل‌های آگارز تفکیک شدند، نیز شناسایی(تسومارا، و همکاران، ۱۹۹۶، کوجیما^[۶۸] و همکاران، ۱۹۹۸و آرکاد^[۶۹] و همکاران، ۲۰۰۰). بنابراین، نیاز به مواد رادیواکتیویته، وقتی نمونه‌های زیادی باید از نظر یک خصوصیت خاص در ژرم‌پلاسم غربال شوند، قابل اجتناب است(ردی و همکاران، ۲۰۰۲).
۲-۱۴-۴ زمینه کاربرد نشانگر ISSR
۲-۱۴-۴-۱ انگشت‌نگاری ژنومی
انگشت‌نگاریDNA، ابزاری مهم برای بیان خصوصیت‌ ژرم‌پلاسم و اثبات شباهت بین ارقام، هیبریدها، منابع والدی و غیره در اصلاح نباتات و مدیریت ژرم‌پلاسم می‌باشد. آغازگرهایی ISSR دو نوکلئوتیدی متصل به انتهای ׳۵ یا ʹ۳، در مطالعات انگشت‌نگاری با تکرارپذیری بالا برای مدیریت کلکسیون ژنومی کاکائو بکار گرفته شده‌اند(کارترس^[۷۰] و همکاران، ۲۰۰۰)ISSR .ها، چندشکلی کافی برای تمایز میان ارقام مختلف گل داوودی را نشان داده‌اند(ولف^[۷۱] و همکاران، ۱۹۹۵). همچنین، ISSRها، امکان تمایز بین گیاهان حاصل از میکروسپور و گیاهان حاصل از کشت سوماتیک در کشت پرچم کتان، را در مراحل ابتدایی گیاهچه فراهم کرده‌اند(چن^[۷۲] و همکاران، ۱۹۹۸).
۲-۱۴-۴-۲ نقشه‌یابی ژنوم