شکل ۴-۱۲: تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی چندشکل در زنبورهای استان‌های مختلف مورد مطالعه
۴-۱۴- دندوگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفومتریک
به منظور تعیین قرابت زنبورهای عسل مورد مطالعه و گروه‌بندی آنها بر اساس داده‌های مرفولوژیکی و مولکولی، دندروگرام اجماعی رسم گردید. بر این اساس زنبورهای پنج استان به سه گروه اصلی تقسیم شدند. گروه اول که در آن خوزستان قرار داشت و گروه دوم که در آن زنبورهای عسل کردستان، و گروه سوم که شامل زنبورهای عسل مرکزی، اصفهان و فارس می‌شود.
شکل ۴-۱۳: دندروگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی
فصل پنجم
بحث و نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از بررسی‌های مرفولوژیکی از کلنی­های نمونه گیری شده پنج استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان و فارس و مقایسه آن با نتایج قبلی اعلام شده در مورد نژاد ایرانی (Ruttner et al., 1985)، تغییراتی در خصوصیات نژاد مورد بررسی مشاهده می‌شود که نشان می‌دهد که این زنبورها در طول سالیان گذشته کوچکتر، چاق‌تر و رنگشان تیره‌تر شده است، که علاوه بر عدم واردات ملکه در طی دهه‌ های گذشته، تکوین و تکامل نژادی نیز از دیگر علل تغییرات مذکور است (طهماسبی و همکاران، ۱۳۷۷).
تفاوت صفات مرفولوژیک می‌تواند به دلیل تفاوت اندازه سلول‌ها در ماه‌های مختلف، کمیت و کیفیت غذای لاروی (Ruttner, 1988)، درجه حرارت مؤثر در رشد لاروها (Soose, 1954) و نیز تأثیر کنه واروآ (Daly et al., 1988) باشد. شریط اقلیمی در فصول مختلف بروی صفات مرفولوژیک تأثیر نشان می‌دهد (طهماسبی، ۱۳۷۶).
دقت در همبستگی صفات ظاهری زنبوران عسل مورد مطالعه نشان می‌دهد که همبستگی بالایی بین طول بال و طول جوگال بال جلویی و همچنین طول و عرض بال جلویی وجود دارد و همبستگی منفی بین زاویه A₄ با سایر صفات وجود دارد. مطالعات روتنر نیز روی زنبوران عسل نشان می‌دهد که همبستگی بالایی بین طول بال جلو، طول خرطوم و قطعات مختلف پای عقب وجود دارد (Ruttner, 1988).‌
مطالعات طهماسبی نشان داد که علاوه بر طول بال جلویی صفات دیگری از جمله طول خرطوم و طول پای عقب و حتی رنگ حلقه‌ها نیز با تغییر شرایط زیستی زنبور عسل در طول ما‌های مختلف، تحت تأثیر قرار می‌گیرند (طهماسبی و همکاران، ۱۳۷۶). بررسی‌های طهماسبی مشخص نمود که نژاد ایرانی از نژادهای خارجی و وارد شده به ایران فاصله زیادی دارد.
بررسی‌های مستأجران بروی زنبور عسل نژاد ایرانی مشخص نمود که میزان همبستگی بالایی بین صفات طول ساق پا، طول و عرض بال جلو و طول بال عقب وجود دارند (Mostajeran et al., 2006).
بررسی‌های طهماسبی نشان می‌دهد که زنبور عسل ایران به سه گروه اشتقاق یافته است، گروه شمال، گروه مرکزی و گروه غربی. گروه شمالی که از مناطق شمالی شامل مازندران و گیلان جمع آوری می‌شود که بزرگ‌تر و دارای بدنی تیره ‌تر می‌باشد. گروه غربی که از غرب ایران جمع آوری می‌شود و گروه گوچکی است و برخی از خصوصیات این گروه از جمله ایندکس کوبیتال شبیه به جمعیت‌های زنبور عسل عراق و سوریه است. گروه مرکزی که از مناطق مرکزی و جنوبی ایران جمع آوری می‌شود که خوصیات بین نا بینی را نشان می‌دهد (طهماسبی و همکاران، ۱۳۷۷).
بررسی‌های رحیمی و اسدی نشان می‌دهد که زنبور عسل سقز به نژاد کردستان نزدیک‌تر است، البته دارای شباهت و تفاوت‌هایی با جمعیت‌های جنوبی نیز می‌باشد که این شباهت‌ها را می‌توان از طریق انتقال برخی کندوها از جنوب به این منطقه توضیح داد (Rahimi & Asadi, 2010).
چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل
نشانگر ISSR نشانگر غالب بوده از این رو بدلیل اینکه تمام آلل‌ها را نشان نمی‌دهد برخی پارامترها نظیر تعداد آلل‌ها، تعداد آلل‌های موثر، تعداد آلل‌ها در هر جایگاه ‌ژنی یا لوکوس، هتروزیگوسیتی (مورد انتظار و مشاهده شده) قابل اندازه‌گیری نیست.
تمایز بین افراد هموزیگوت و هتروزیگوت با نشانگر غالب امکان پذیر نیست لذا تفاوت بین جمعیت‌های زنبور عسل در یک جایگاه ژنی (gst) و تفاوت بین جمعیت‌ها در چندین جایگاه ژنی (Gst) قابل اندازه‌گیری نیست به عبارتی این پارامترها برای نشانگرهای مولکولی همبارز مناسب بوده و دارای محدودیت‌هایی برای نشانگرهای غالب نظیر ISSR و RAPD می‌باشند زیرا به دلیل عدم تکرار پذیری یا تکرار پذیری کم این نشانگرها تعداد نمونه زیاد و چندین نسل از هر جمعیت لازم است تا پارامتر محاسبه شده دقیق و درست باشد.

هر آزمایش تکثیر باید جهت اطمینان از فراورده تکثیر تکرار گردد اگر باند ویژه‌ای که در یک تکرار دیده شد در تکرار دوم دیده نشده باشد آن نباید مورد نمره‌دهی جهت آنالیز قرار گیرد. با این وجود بر اساس آنالیزهای بسیار صورت گرفته در این تحقیق مطالعه فردی و مطالعه بیش از ۵ فرد تغییری چشمگیری در نتایج نشان نداد.
بسته به نوع مطالعه مورد نظر در جمع‌ آوری داده‌ها و نمره‌دهی آنها رهیافت‌های مختلفی ارائه می‌شود. در مطالعه‌ای که هدف آزمایش جریان ژنی است نظیر آنالیز والدین و دورگ‌گیری در میان جمعیت‌ها یا گونه داده‌های مورد نیاز کیفی هستند و جهت تجزیه کیفی نیازمند نشانگر تیپیک در فرد، جمعیت یا گونه هستیم که بتوان در ارزیابی مقدار جریان ژنی از آن استفاده کرد (Wolf et al., 1998a,b). به منظور تشخیص این نشانگر آغازگرهای متعددی باید روی جمعیت یا تاکسای مورد نظر، مورد آزمایش قرار گیرند.
برای نشانگرهای ویژه جمعیت چندین فرد باید جهت ردیابی و یافتن نشانگر ویژه در یک جمعیت مورد بررسی قرار گیرد. اگر نشانگر ویژه گونه یا جمعیت تشخیص داده شوند آغازگرهای مشخص جهت تکثیر DNA از همه افراد درگیر در مطالعه استفاده و تنها باندهای واضح ISSR آنالیز خواهند شد.
مطالعه تنوع ژنتیکی همچون مطالعه حاضر نیازمند رهیافت کمی است که هدف بدست آوردن باندهای زیاد در گونه یا جمعیت است. پی برده شد که ۲۵ فرد در هر جمعیت راندمان مناسبی جهت ارزیابی الگوی تنوع ژنتیکی ارائه می‌دهد. مطالعات سیستماتیک مرزبندی گونه روی نمونه‌برداری در عرض دامنه جغرافیایی گونه متمرکز شده است و جهت آنالیز بررسی دامنه جغرافیایی آنالیز ۵ فرد از هر جمعیت مناسب می‌باشد. یک مطالعه ISSR تیپیک شامل ۳ تا ۱۰ آغازگر و چند صد فرد خواهد بود. آغازگرهای کاندید بوسیله تست آغازگر هر تاکسون انتخاب و آغازگرهای تولید کننده باندهای قابل تشخیص جهت تکثیرهای بعدی بهینه می‌گردند. به خاطر تفاوت زیاد در نشانگر ISSR ژنوتیپ همه افراد در یک مطالعه با ۱ تا ۳ آغازگر بررسی می‌گردد.
بنابراین دو راهبرد بسته به نوع هدف پیشنهاد می‌گردد:
رهیافت کیفی
وقتی ISSR به منظور مطالعه الگوی جریان ژنی استفاده می شود ارزیابی فراوانی نسبی باند ویژه ISSR در هر تاکسون در انتخاب آن نشانگر برای تاکسون ویژه دارای اهمیت است (Wolf et al, 1998a,b, 2001). الگوی نشانگرهای اضافی و توزیع آنها در مطالعه جریان ژنی استفاده می‌شود برای مثال اگر فرضیه گونه‌زایی هیبرید C از تاکسون‌های A و B مطرح باشد وجود باندی ویژه از تاکسون Aو باندی ویژه از تاکسون B در هیبرید جدید قابل تصور می‌باشد. اگر گونه مشتق شده هیبرید نسبتاً جوان باشد انتظار می‌رود تا آلل‌های جدید را در آن ببینیم. به دلیل طبیعت تغییر پذیری زیاد ISSR انتظار می‌رود آلل‌های بیشتری در گونه مشتق شده هیبرید نسبت به آنچه در مطالعه آلوزایم‌ها دیده می‌شود مشاهده گردد. الگوی نامتقارن جریان ژنی به آسانی توسط نشانگر ISSR کشف می‌شود (Wolf et al., 1998b). نشانگرهای با فراوانی کم در یافتن این الگوها در مقایسه با نشانگرهای تیپیک گونه گهگاهی مفید هستند (Archibald et al., 2004). بعد از تشخیص آلل‌های نشانگر ویژه فراوانی وجود نشانگر در تاکسون علاقه مورد اندازه‌گیری است و فرضیه جریان ژنی بر پایه الگوی یافت شده مورد ارزیابی قرار می‌گیرد.
رهیافت کمی
داده‌های ISSR می‌تواند با بهره گرفتن از آمار مقایسه‌ای و تفسیری جهت ارزیابی سطح تنوع و تغییر ساختار جمعیتی مورد استفاده قرار گیرد. در آنالیز نشانگر غالب تخمین فراوانی آلل مورد نیاز است چون احتمال استقرار ژنوتیپ از داده‌های ISSR به تنهایی وجو ندارد.
باندها به صورت جایگاه ژنی دی‌آللی نمره‌دهی می‌شوند که وجود باند می‌تواند بیانگر دو آلل یا تنها یک آلل می‌باشد و غیبت باند هموزیگوزیتی اشاره می‌کند زیرا غیبت باند ممکن است نتیجه اتصال نادرست آغازگر^[۷۸] در انتهای توالی SSR یا حوادث حذف و اضافه و تغییر در وزن مولکولی قطع تکثیر شده باشد.
بهترین پارامترها برای اندازه‌گیری در مورد نشانگر غالب برای مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل تعداد باندهای تشکیل شده برای هر آغازگر و نژاد، تعدا کل باندهای تولیدی برای هر آغازگر و نژاد، تعداد باندهای تک‌شکل و چندشکل تشکیل شده، درصد چند شکلی، محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، قدرت حل (RP)، نرخ موثر چندگانه (EMR)، تشابه و فاصله ژنتیکی با روش UPGMA و روش جاکارد، آنالیز خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی می‌باشد.
بررسی کارایی و تعداد باندهای تولیدی آغازگرها در نژادهای مختلف زنبورعسل مورد مطالعه
تعداد باندهای تولید شده در مطالعات بین ۴ تا ۱۲ باند بود که در مقایسه با مطالعات دیگر تفاوت‌هایی را نشان می‌دهد چنانچه این تعداد باند تکثیر شده در زنبور عسل ۲ تا ۱۰ باند (Paplauskiene et al., 2006; Al-Otaibi, 2008)، در کرم ابریشم بین ۳ تا ۱۴ باند (Velu et al., 2008)، در Antherae mylitta بین ۵ تا ۱۶ باند (Kar et al., 2005)، ۱۴ تا ۲۶ باند در مگس‌های Simuliidae (Dusinsky et al., 2006)، ۰ تا ۱۲ باند در پروانه‌های Noctuidae (Hundsdoerfer and Wink, 2005)، ۲۵ تا ۳۲ باند در Homalodisca coagulate (De león and Walker, 2004) متفاوت بود بخشی از این تفاوت مربوط به بکارگیری آغازگرهای متفاوت دی‌نوکلئوتید، تری‌نوکلئوتید و تترانوکلئوتید و بخشی دیگر مرتبط با نوع آغازگر به کار رفته به صورت معمولی یا انکورد شده در هر یک از دو انتهای َ۳ یا ۵َ می باشد (Reddy et al., 2002). البته بسته به گونه مورد مطالعه این نتایج متفاوت می‌باشد چنانچه در بررسی تنوع درون و بین گونه‌ای مگس‌های Simuliidae آغازگرهای تترانوکلئوتیدی با توالی‌های ACAG، GACA و ACTG کارایی بهتری از خود نشان دادند و درصد بالایی چندشکلی با کاربرد این آغازگرها ثبت شد (Dusinsky et al., 2006). در بررسی صورت گرفته در این مطالعه آغازگرهای دی نوکلئوتید تعداد باند بیشتری در مقایسه با آغازگرهای دیگر تولید نمودند، که البته با نتایج سایر مطالعات تفاوتهایی مشاهده می‌شود‌ (Al-Otaibi, 2008; Paplauskiene et al., 2006).
مطالعات نشان دادند که ژنوم زنبور عسل دارای توالی‌های A+G و A+C می‌باشد. توالی‌های A+G و A+C موفق‌ترین و پرشمارترین توالی‌ها در بررسی ژنوتیپی و بررسی چمعیتی چهار گونه جانوری Pemphigus obesinymphae، Acythosiphus pisum، Aedes aegypti و Philodina معرفی شدند (Abott, 2001). توالی‌های حاوی AC و AG فراوان‌ترین و عمومی‌ترین توالی‌ها در گروه‌های جانوری همچون حشرات از جمله مگس سرکه و سایر حشرات می‌باشند (Schug et al., 1998a,b).
آغازگرهای معمولی تفاوت‌های بسیاری در تعداد و میزان تولید باند در مقایسه با آغازگرهای انکورد شده از خود نشان می‌دهند چنانچه از آغازگرهای معمولی بدون ایجاد تغییر در انتهای آنها استفاده گردد باندهای واضح کمی تشکیل می‌گردد و میزان اسمیر زیادی مشاهده خواهد شد و در صورتی که از آغازگرهای انکورد شده با ۱ تا ۴ باز در یکی از دو انتهای آغازگر استفاده گردد میزان تولید باند کاهش یافته و در عوض باندهای واضح (برای آغازگرهای انکورد شده در انتهای َ۳) یا باندهای بزرگتر (برای آغازگرهای انکورد شده در انتهای ۵َ) تولید خواهند شد (Reddy et al., 2002). در کل آغازگرهای تترانوکلئوتید فراوانی کمتری در ژنوم‌های گیاهی و جانوری دارند و توالی‌های AT به دلیل اتصال به خود طی فرایند زنجیره پلیمراز در مرحله اتصال آغازگر به الگو اصلاً تکثیر نشده و باندی تولید نمی‌کنند. البته برای گونه‌های مختلف گیاهی و جانوری باید فراوانی هر یک از توالی‌ها که به عنوان آغازگر استفاده می‌شوند به طور مفصل مورد بررسی قرار گیرد.
بر طبق نتایج بدست آمده ۲۵ باند دارای چند شکلی بود که متوسط آن برای آغازگر حدود ۵ باند بود. این داده‌ها نشان می‌دهد که اکثر نواحی تحت بررسی دارای چند شکلی بوده‌اند، این نتایج با مشاهدات سایر پژوهشگران تا حدودی تطابق دارد، در مطالعات پاپلوسکینه این میزان ۴ قطعه چند شکل برای هر آغازگر و این میزان در مطالعات اَل اُتَیبی ۴/۳ برای هر آغازگر بود (Paplauskiene et al., 2006; Al-Otaibi, 2008).
محدوده قطعات بدست آمده بین ۱۰۰۰-۱۵۰ می‌باشد که در بررسی‌های پاپلوسکینه این میزان ۳۰۰۰-۳۵۰ و در مشاهدات اَل اُتَیبی این محدوده ۸۵۰-۱۰۰ بود(Paplauskiene et al., 2006; Al-Otaibi, 2008)..
مقایسه بین نژادهای مورد بررسی با محاسبه درصد جایگاه چند شکلی محاسبه شد و براساس نتایج میزان چند شکلی در نژادهای مورد مطالعه برای خوزستان ۳۳/۵۳ درصد، اصفهان ۴۲/۴۲ درصد، فارس با ۱۴/۳۷ درصد و این میزان برای مرکزی و کردستان ۲۵/۳۲ درصد بدست آمد، اَل اُتَیبی درصد جایگاه چند شکلی را در زنبورهای بومی ۵۷/۸۸ درصد، برای برای زنبورهای عسل هیبرید ۶۱/۵۱ درصد و برای نژاد کارنیولان این میزان را ۷۸/۳۴ درصد محاسبه نمود (Paplauskiene et al., 2006; Al-Otaibi, 2008).
نتایج نشان می‌دهد که تکنیک ISSR روش مناسبی برای تشخیص میزان چند شکلی در زنبور عسل است. نتایج بدست آمده نشان داد که باندهای ISSR در تکرارهای فراوان بروی نژادهای مختلف بسیار تکرار پذیر هستند، در مقایسه با سایر تکنیک‌های مولکولی که حتی در میان نژادهای نزدیک نیز الگوهای متفاوتی از باندها را آشکار می‌سازند و این نتایج با سایر پژوهش‌ها تا حدودی تطابق داشت(Al-Otaibi, 2008).
نتایج بدست آمده از میزان شباهت‌ها از لحاظ ژنتیکی نشان دهنده‌ی میزان کم تفاوت بین نژادهای مورد بررسی در ۵ استان مختلف دارد، که این می‌تواند بدلیل کوچ‌های پی در پی زنبوران مناطق مختلف به استان‌های همجوار باشد. اگرچه نمونه برداری های انجام شده در این پژوهش از زنبوردارانی انجام گرفته است که هرگز کوچ خارج از استان نداشته‌اند ولی با توجه به داد و ستد رایج کلنی‌های زنبور عسل در میان زنبورداران هر شهر و استان باهم، این احتمال وجود دارد که این گونه روابط باعث پایداری و یکسان شدن نژادهای مورد بررسی باشد.
بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه
علی‌رغم اهمیت تنوع درون گونه‌ای و تنوع برون گونه‌ای در انتخاب نژادهای مناسب برای انتخاب والدین مناسب برای اصلاح نژاد تاکنون مطالعه‌ای در جهت اصلاح نژاد صورت نگرفته و بیشتر اصلاح نژاد به طریق سنتی و انتخاب والدین با عملکرد مناسب و تلاقی آنها صورت می‌گیرد.