2-3 – طراحی پرایمر
2-4- مدل ژنی ژنهای استفاده شده برای طراحی پرایمرها
2-5 – مشخصات پرایمرهای طراحی شده
2-6- تهیه نمونه DNAی ژنومی
2-7 – تعیین کیفیت و کمَیَت نمونههای DNA
2-8- واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تست پرایمرها
2-9 – آزمون کارآیی پرایمرهای طراحی شده ….
2-10 – واکنش توالییابی
2-11 – آنالیز ژنتیکی دادههای توالییابی
فصل سوم- نتایج و بحث
3-1- آنالیزقطعه کامل ژن HKT1
3-2 – آنالیزقطعه کامل ژن CBL4
3-3 – تخمین فراوانی نسبی SNP
3-4 – موتاسیونهای هموزیگوت در قطعات کامل توالی …
3-5- درخت فیلوژنی ژن HKT1
3-6- درخت فیلوژنی ژن CBL4
3-7- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن HKT1
3-8- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4
3-9- آنالیز ژن HKT1 براساس قطعات تکثیری پرایمرها
3-9-1- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
3-9-1-1 موتاسیونهای حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
3-9-1-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
3-9-2- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-2
3-9-2-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-2
3-9-2-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-2
ح
فهرست مطالب
عنوان
صفحه
3-9-3- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3
3-9-3-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3
3-9-3-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3
3-9-4- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4
3-9-4-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4
3-9-4-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4
3-10- آنالیز ژن CBL4 بر اساس قطعات تکثیری پرایمرهای این ژن
3-10-1- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1
3-10-1-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1
3-10-1-2- – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1
3- 10-2- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2
3-10-2-1 موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2
3-10-2-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2
3-10-3- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3
3-10-3-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3
3-10-3-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3
3-10-4- آنالیز قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4
3-10-4-1- موتاسیونهای حذف و اضافه نوکئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4
3-10-4-2- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4
3-11- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3
3-12- نقشههای هضم آنزیمی
3-13- حذف و اضافههای (Indels) نوکلئوتیدی
3-14- آنالیز هاپلوتیپی
3-15- آنالیز هاپلوتیپی
3-16- مشخصات مورفولوژیکی هاپلوتیپها
3-17- بررسی مورفولوژیکی هاپلوتیپها
3-18- نتیجه گیری کلی
3-19- پیشنهادات
پیوستها:
منابع
خ
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 1- شبکه سیگنالدهی CBL-CIPK در پاسخ به تنشهای غیر زنده
شکل2- مسیر اختصاصی سیگنال دهی گیاه در پاسخ به تنش شوری
شکل 2-1- منطقه کد کننده پروتئین ژن calcineurin B-like protein 4 (CBL4) در رقم Clipper جو
شکل2- 2- توالی کامل ژن CBL4 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژن
شکل 2-3- مدل ژنی ژن HvHKT1
شکل 2- 4 – توالی کامل ژن HvHKT1 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژن
شکل 2-5- گیاهچههای 14 روزه که برای تهیه نمونه برگی استفاده شدند
شکل 2-6- دستگاه Freezdryer برای خشک کردن نمونههای برگی
شکل 2-7- دستگاه گریندر برای پودر کردن نمونههای برگی
شکل 2-8- تصویرژل نمونههای DNA
شکل 2-9- دستگاه ترموسایکلر مدل ABI Vertri 96
شکل 2-10- محصول PCR پنج پرایمر …
شکل 2-11- دستگاه ABI3100 برای توالی یابی محصولات PCR و آنالیز ژنتیکی
شکل 2-12- نمونهای از کروماتوگرام نمونههای توالییابی شده
شکل 3- 1- توالی نوکلئوتیدی قطعه کامل ژن HKT1
شکل 3- 2 – توالی نوکلئوتیدی قطعه ژنی ژن CBL4
شکل 3- 3- درخت فیلوژنی ژن HKT1
شکل 3-4- درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ اول
شکل 3- 5 – درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ دوم
شکل 3-6– درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ سوم
شکل 3-7– درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگچهارم
شکل 3-8– درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ پنجم
شکل 3-9– درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ ششم
شکل 3- 10- نقشه هضم آنزیمی ژن HKT1
شکل 3- 11- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ اول
شکل 3- 12 نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ دوم
شکل 3- 13- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ سوم
شکل 3- 14- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ چهارم
شکل 3- 15- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ پنجم
د
فهرست شکلها
عنوان
صفحه
شکل 3- 16- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ ششم
شکل 3- 17- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ هفتم
شکل 3- 18- توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1
شکل 3- 19- محل وقوع یک موتاسیون حذف نوکلئوتیدی …
شکل 3- 20 – 
نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 1
شکل 3- 21 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-2
شکل 3- 22 – بخشی از کروماتوگرام ژنوتیپ شماره 9 …
شکل 3- 23- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 2
شکل 3- 24 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3
شکل 3- 25- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-3
شکل 3- 26 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-4
شکل 3- 27 – کروماتوگرام ژنوتیپهای شماره 81 (شکل بالا) و 91 (شکل پائین)
شکل 3- 28 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 4
شکل 3- 29- توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4- 1
شکل 3- 30- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 در کانتیگ اول
شکل 3- 31 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 در کانتیگ دوم
شکل 3- 32 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1 در کانتیگ سوم
شکل 3- 33 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2
شکل 3- 34 – کروماتوگرام ژنوتیپ شماره 12 که محل وقوع 3 موتاسیون حذفی را نشان میدهد
شکل 3- 35- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2
3- 36 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2
شکل 3- 37- نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3
شکل 3- 38 – توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4
شکل 3- 39 – نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر CBL4- 4
شکل 3- 40- توالی نوکلئوتیدی هاپلوتیپهای ژن CBL4 در مناطق دارای SNP
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
جدول 2-1- نام و توالی پرایمرهای طراحی شده برای ژنهای HvHKT1 و CBL4
جدول 2-2 – مواد مورد نیاز برای واکنش PCR
جدول 2-3- مواد مورد نیاز برای انجام دومین واکنش PCR در توالییابی
جدول 3-1 – مشخصات انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری ژن HKT1
جدول 3-2- مشخصات انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری ژن CBL4
جدول 3-3- مشخصات ژنوتیپهای شاخه اصلی اول در درخت فیلوژنی ژن HKT1
جدول 3-4- مشخصات ژنوتیپهای شاخه اصلی دوم در درخت فیلوژنی ژن HKT1
جدول 3-5- مشخصات ژنوتیپهای شاخههای اصلی سوم، چهارم، پنجم وششم در درخت فیلوژنی ژن HKT1
جدول 3-6 – مشخصات ژنوتیپهای شاخههای اصلی هفتم در درخت فیلوژنی ژن HKT1
جدول 3-7- مشخصات ژنوتیپهای شاخههای اصلی هشتم، نهم، دهم، یازدهم و دوازدهم در درخت فیلوژنی ژن HKT1
جدول 3-8- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ اول
جدول 3-9- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ دوم
جدول 3-10– مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ سوم
جدول 3- 11- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ چهارم
جدول 3-12- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ پنجم
جدول 3-13- مشخصات ژنوتیپهای درخت فیلوژنی ژن CBL4 در کانتیگ ششم
جدول 3-14- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن HKT1
جدول 3-15- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ اول
جدول 3-16- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ دوم
جدول 3-17- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ سوم
جدول 3-18- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ چهارم
جدول 3-19- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ پنجم
جدول 3-20- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه …
ر
فهرست جدولها
عنوان
صفحه
3-21- تعداد موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-1
3-22- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی …
3-23- تعداد و انواع موتاسیونهای حذف و اضافه در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-2
3- 24- تعداد انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-2
3-25- تعداد انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-3
3-26- تعداد انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-4
3-27- تعداد و انواع موتاسیونهای حذف و اضافه نوکلئوتیدی در کانتیگ های قطعه تکثیری …
3-28- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-1
3-29- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری …
3-30- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-2
3-31- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-3
3- 32- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری ….
3-33- تعداد و انواع موتاسیونهای حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4
3-34- تعداد و انواع موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر CBL4-4
3-35- مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیمهای برشی در قطعه تکثیری …
3-36- دسته بندی ژنوتیپها
3-37- مشخصات گروه هاپلوتیپی
3-38- مشخصات آماری SNPهای بالقوه و واقعی در دسته سوم
3-39- مشخصات آماری SNPهای واقعی و هاپلوتیپها در دسته سوم
3-40- مشخصات کامل SNPهای بالقوه در دسته سوم
3-41- مشخصات مورفولوژیکی سه هاپلوتیپ شناخته شده در آزمایش
مقدمه:
افزون بر 20% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی میباشد (28). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار میدهد (51). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (15). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنشهای زنده و غیر زنده بیش از 50% کاهش مییابد (146). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند 1) عدم تعادل یونی 2) کمبود مواد معدنی 3) تنش اسمزی 4) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو میگردد (64). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل مییابد (134) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش میدهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی میباشد (84). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: 1- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیتها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، 2- استفاده از موتاسیونهایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن میگردند برای شناسائی و مطالعه ژنهای مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (6)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و 3- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (154)، برنج (77 و 155) و سیب زمینی (93) میباشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک میکند (27). افزایش گیاهان متحمل (124) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (111). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت میگردد (112 و 20). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت میکند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک مینماید (94).
جو یکی از متحملترین گیاهان زراعی است که طی سالها، از روشهای مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (149). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار میباشد (105). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد مییابند دارای تنوع ژنتیکی گستردهتری هستند (88). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (69). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه میباشد (15 و 138). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساسترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی میباشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش مییابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (134)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی میباشد (74). بین تحمل به شوری در دو مرحله رشدی جوانهزنی و گیاهچگی هیچ رابطهای وجود ندارد (74). مکانیسمهای تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: 1- انتقال یون سدیم از برگهای گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون میشود (38) و 2- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگهای جو به داخل سلولهای مزوفیل نسبت به توزیع آنها در سلولهای اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلولهای مزوفیل میشود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (56).
استراتژیهای حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژنهای کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (65).
دو ژن CBL4 و HKT1 نقش مهمی در تحمل گیاه جو نسبت به تنش شوری دارند که نقش و اهمیت آنها به طور خلاصه ذکر میگردد. سیگنالهای حاصل از یون کلسیم، مبدَلها و تنظیم کنندههای اصلی در فرآیندهای سازگاری و نموَی گیاهان هستند. این سیگنالها به واسطه اثرات تحریکی خاص ناشی از فعال شدن همزمان کانالها، پمپها و انتقال دهندههایی که به صورت دمائی و فضایی افزایش یون کلسیم را نشان میدهند، بروز مییابند (59). مشخصترین مسیر سیگنالدهی که مختص تنش شوری است نیز شامل افزایش یون کلسیم در سیتوسول میباشد (161). در این مسیر، افزایش القائی یون سدیم در سیتوسول احتمالاً از طریق یک پروتئین calcineurin B-like به نام CBL4 که اصولاً تحت عنوان SOS3 شناخته شده است، تشخیص داده میشود. کمپلکس CBL4/CIPK24 (SOS3/SOS2) از طریق زنجیره اسید چرب مریستول با CBL4/SOS3 پیوند کووالانسی تشکیل میدهد (Ishitani, 2000) که موجب فسفریلاسیون و در نتیجه فعال شدن آنتی ریپورتر Na+/H+ موجود در بخش مرزی غشاء یعنی SOS1 میگردد (104، 106 و 126). سیستم سیگنالدهی CBL/CIPK برای ترجمه سیگنالهای یون کلسیم به شکل فسفریلاسیون پروتئینی است که کمپلکسهای شرکت کننده در پروتئینهای CBL و CIPK هایی را که با آنها اثر متقابل دارند، مانند AKT1، ترانسپورتر یون پتاسیم در آرابیدوپسیس یا SOS1، عامل حساسیت عمومی نسبت به شوری یا CHL، ترانسپورتر نیترات یا AHA2 و H+ATPase 2 در آرابیدوپسیس، را مشخص میکند (86). چند نوع CBL وجود دارد مانند CBL1، CBL4 و CBL9، که با اعضای غشائی در ارتباط هستند (54 و 68). در مورد CBL4/SOS3، نشان داده شده است که مریستوله شدن برای تحمل به شوری مهم و ضروری بوده است (54). اولین CBL شناخته شده با روش ژنتیکی SOS3/CBL4 بوده است. این نشان میدهد که SOS3/CBL4 در تحمل به شوری از طریق حسگر یون کلسیم دارای نقش اختصاصی میباشد. ژنهایی که گیاه را قادر به محدود کردن تجمع یون سدیم در بافت شاخه مینمایند دارای منابع بالقوهای از تحمل نسبت به شوری در اصلاح نباتات هستند. در جو، لوکوس HvNaX4 مقدار یون سدیم در شاخه را بین 12 و 59 درصد کاهش میدهد. بسته به شرایط هیدروپونیک و نوع خاک تأثیر قوی محیط روی بیان این ژن مشخص میگردد (112). لوکوس ژنی HvCBL4 در جو با ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس همولوگ بوده و با HvNaX4 به طور همزمان تفرق مییابد (112).
