فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه

1
فصل اول: کلیات………………………………………………………………………………..
2
1-1 گیاه­شناسی کلزا………………………………………………………………………………
2
1-1-1 ارقام کلزا………………………………………………………………………………
4
1-1-2 کلزا و اهمیت اقتصادی آن……………………………………………………………………
5
1-2 تنش خشکی………………………………………………………………………………..
8
1-2-1 مکانیسم­های مقاومت به خشکی در گیاهان زراعی……………………………………………….
11
1-2-2 اثر تنش خشکی بر روی کلزا…………………………………………………………………
12
1-2-3- ﺗﺄثیر  تنش خشکی بر رشد و فتوسنتز………………………………………………………
14
1-2-4 اثر تنش خشکی روی آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و مالون­دی­آلدهید………………………………
18
1-2-5 ﺗﺄثیرتنش خشکی بر میزان نیترات و نیترات ردوکتاز…………………………………………….
19
1-2-6 ﺗﺄثیر  تنش خشکی بر القای اسمولیت­های سازگار………………………………………………
21
1-3 کلیاتی در زمینه مسیر درک علامت (Singal transduction) در گیاهان…………………………….
21
1-3-1 اثر تنش­های محیطی در فرایند­های مولکولی در گیاهان………………………………………………………….
23
1-3-2 مسیرهای ژن­های کنترل کننده تنش­های غیر­زنده………………………………………………………………………
24
1-4 ژن­های مورد مطالعه…………………………………………………………………………………………………………..
24
1-4-1 پروتئین‌کینازها………………………………………………………………………………………………………………
26
1-4-2 خانواده ژنیMAPK  ……………………………………………………………………………………………………..
28
1-4-3 ژن حساس به اکسین………………………………………………………………………………….
33
فصل دوم: مواد و روش­ها………………………………………………………………………
34
2-1 شرایط رشد………………………………………………………………………………………………………………….
34
2-1-1 نحوه تیمار­دهی گیاهان…………………………………………………………………………………………………
35
2-1-2  برداشت نمونه……………………………………………………………………………………………………………
35
2-1-2-1 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های مولکولی……………………………………………..
35
2-1-2-2 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های فیزیولوژیک………………………………………………………………
36
2-2 روش های بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی………………………………………………………………………..
36
2-2-1 پودر کردن و آماده سازی نمونه جهت استخراج RNA ………………………………………………………….
36
2-2-2 استخراج RNA از بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………………
36
2-2-3 اندازه­گیری میزان غلظت RNA و رقیق سازی نمونه­ها…………………………………………………………………..
37
2-2-4- روش تهیه cDNA………………………………………………………………………………………………
37
2-2-5- واکنش RT-PCR………………………………………………………………………………………………
38
2-2-6 تهیه ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………..
38
2-2-6-1 تهیه TBE 5X…………………………………………………………………………………………………
38
2-2-7 پرایمر­های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………….
38
2-3 روش­های بکار گرفته شده در آزمایشات فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………
38
2-3-1  طرز تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم­های آسکوربات و گایاکول پراکسیداز…………………….
39
2-3-1-1 اندازه­گیری فعالیت آنزیم آسكوربات پراكسیداز(APX)………………………………………………………
39
2-3-1-2 اندازه­گیری فعالیت آنزیم گایاكول پراكسیداز(GPX)………………………………………………………..
39
2-3-2 سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز………………………………………………………………………………………………………………..
40
2-3-3 اندازه­گیری میزان پراکسیداسیون چربی­ها (MDA)……………………………………………………………………………….
40
2-3-4 اندازه­گیری پروتئین کل…………………………………………………………………………………………………………….
41
2-3-5 اندازه­گیری قندهای محلول………………………………………………………………………………………………………………….
41
2-4 آنالیزهای آماری…………………………………………………………………………………………………………………………..
42
فصل سوم: نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………….
43
3-1 نتایج حاصل از بررسی­های انجام یافته در سطح مولکولی…………………………………………………………………………….
43
3-1-1 بررسی بیان ژن Protein Kinase تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)………………………….
45
3-1-2 بررسی بیان ژن MAPK4 تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)…………………………………….
46
3-1-3 بررسی بیان ژن MAPK3 تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)…………………………………….
48
3-1-4 بررسی بیان ژنAuxin responsive protein   تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)……………
49
3-2 بررسی نتایج حاصل از آزمایشات فیزیولوژیکی…………………………………………………………………………………………….
49
3-2-1 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پر­اکسیداز (GPX) درگیاه کلزا………………………………
50
3-2-2 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) درگیاه کلزا……………………………..
52
3-2-3 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) درگیاه کلزا……………………………………………..
53
3-2-4 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان مالون­دی­آلدهید (MDA) درگیاه کلزا…………………………………………………
55
3-2-5  بررسی اثر تنش خشکی بر میزان پروتئین کل درگیاه کلزا…………………………………………………………………………..
55
3-2-6 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان قندهای محلول درگیاه کلزا………………………………………………………………………
57
فصل چهارم: بحث و بررسی…………………………………………………………………………………………………………………………….
58
4-1- بررسی‌های انجام شده در سطح مولکولی……………………………………………………………………………………………………
61
4-2 بررسی­های انجام شده در سطح فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………………………….
66
4-3 نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………..
67
4-4 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….
68
5- ضمائم…………………………………………………………………………………………………………………………………………..
71
6- منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………….
 

چکیده

تغییرات مداوم آب وهوا، مسئول القای چندین عامل تنش­زا در گیاهان می­باشد. در بین این عوامل، خشکی به­عنوان مهم­ترین تنش غیرزیستی شناخته می­شود. برای مقابله با این شرایط گیاه باید قادر به درک، پاسخ­دهی و سازگاری نسبت به این تغییرات محیطی بوده و فعالیت­های فیزیولوژیکی خود را تغییر دهد. صدها ژن در گیاهان در پاسخ به تنش رطوبتی القا می­شوند. شناسایی و بررسی ویژگی­های ژن­های تنظیم کننده­ی کلیدی دخیل در تحمل خشکی اهمیت فوق­العاده­ای در بهبود ژنتیکی گیاهان دارد. در این تحقیق از دو رقم حساس و مقاوم به خشکی گیاه کلزا (Brassica napus L.) بنام­های Okapi (حساس به خشکی) و      Zarfam (مقاوم به خشکی) استفاده شد. هدف از این پژوهش مطالعه­ی بیان 4 ژن درگیر در مسیر ترارسانی علامت (signal transduction) تحت تنش خشکی در دو رقم اکاپی و زرفام می­باشد. بعد از استخراج RNA و ساخت cDNA، پروفایل بیان 4 ژن شامل Protein kinas (PK) ، Auxine– responsive protein، MAPK3 و MAPK4  در زمان­های 0، 3، 12و 24 ساعت خشکی تحت تیمار مانیتول mM  200 در گیاهچه­های 8 روزه کلزا با تکنیک RT-PCR بررسی شد. آزمایش روی کل گیاهچه (Seedling) انجام گرفت. نتایج نشان داد که ژن­های،  Protein kinas (PK) و MAPK4 در رقم حساس، به­طور معنی­داری افزایش و در رقم مقاوم، به­طور معنی­داری کاهش سطح بیان نشان داده است. همچنین میزان بیان ژن­ MAPK3 در هر دو رقم افزایش یافته، ولی میزان بیان ژن Auxine- responsive protein در رقم حساس افزایش و در رقم مقاوم کاهش پیدا کرده است. شناخت دقیق نقش این ژن­ها، اصول استراتژی­های مهندسی ژنتیک موثری برای بهبود تحمل تنش کلزا به ما ارائه خواهد داد. علاوه بر تاثیر تنش مذکور در سطح مولکولی، پاسخ گیاهان در سطح فیزیولوژیکی نیز مورد بررسی قرار گرفت. تنش خشکی موجب احساس کمبود آب در گیاه و در نتیجه بسته شدن روزنه­ها و افزایش احتمال تولید گونه­های اکسیژن فعال در گیاهان می­گردد. افزایش فعالیت آنزیم­های APX و GPX و CAT، به­عنوان آنتی اکسیدان آنزیمی، دلالت بر این فرایند درون سلولی دارد. با توجه به نتایج بدست آمده، افزایش ROS  موجب افزایش پراکسیداسیون چربی و در نتیجه افزایش سطح MDA  در گیاه گردید. تجمع محلول­های سازگار نیز از جمله مکانیسم­های دفاعی گیاه در برابر تنش کم آبی بوده که خود را در تجمع کربوهیدرات­ها در گیاه نشان داد. با بررسی مطالب فوق نتیجه­گیری شد که تنش خشکی اثر زیانباری بر رشد گیاه کلزا داشته و رقم اکاپی دارای حساسیت بالا و رقم زرفام دارای حساسیت پائینی نسبت به تنش خشکی می­باشد.