تاکنون چندین پیشنهاد درباره نقش BLG در شیر گاو ارائه شده است ولی هیچ‌ یک از آن‌ ها یک عملکرد فیزیولوژیکی مشخص را توضیح نمی‌دهد. BLG در فرم طبیعی (دیمر) به اسیدهای معده بسیار مقاوم است، به همین دلیل عملکرد اولیه‌اش تغذیه‌ای نیست (Mansouri, Haertle et al. ۱۹۹۷, Papiz, Sawyer et al. ۱۹۸۶). احتمالاّ BLG در فعالیت لیپاز^[۹۱] در پیش معده (Perez, Sanchez et al. ۱۹۹۲) و افزایش انتفال اسیدهای چرب و رتینول به دلیل پایداری در pH اسیدی دخیل است (Burczynski, Moran et al. ۱۹۹۰, Puyol, Dolores Perez et al. ۱۹۹۵). این پروتئین به صورت دست‌نخورده به روده کوچک می‌رسد و سپس در آن‌جا هضم شده و مولکول‌های متصل به آن آزاد می‌شوند. همچنین پیشنهاد شده‌است که پپتید‌های فعال زیستی تشکیل شده از BLG برای نوزادان مفید هستند (Sawyer and Kontopidis 2000, Yamauchi, Usui et al. ۲۰۰۳) و ایمنی غیرفعال^[۹۲] را بهبود می‌بخشند. BLG به دیواره روده متصل شده و احتمالا جایگزین بسیاری از میکروارگانیسم‌های^[۹۳] مضر در روده‌ی نوزادان می‌شود (Ouwehand, Salminen et al. ۱۹۹۷).

یکی دیگر از عملکرد‌های احتمالی که برای BLG در نظر گرفته شده‌است توانایی این پروتئین در جلوگیری از فعالیت آنزیم فسفوپروتئین فسفاتاز^[۹۴] طحال است که بر روی سوخت و ساز فسفات در داخل سلول‌های غدد پستانی اثر می‌گذارد. BLG گاوی از هیدرولیز پارانیتروفنیل‌فسفات^[۹۵] توسط فسفوپروتئین‌فسفاتاز‌های ترشح شده توسط طحال جلوگیری می‌کند (Farrell Jr and Thompson 1990).
مطالعات دیگری بر روی BLG نشان داد که این پروتئین می‌تواند تحریک کننده دستگاه ایمنی بدن باشد. بونوس^[۹۶]، کنگ‌شاون^[۹۷] و گلد^[۹۸] در سال ۱۹۸۸ تحقیقات گسترده‌ای بر روی خصوصیات دستگاه ایمنی بدن در حضور غلظت‌های مختلفی از BLG شیر گاو انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که خواص ایمنی بدن با افزایش غلظت این پروتئین، افزایش می‌یابد، به عبارت دیگر حضور BLG باعث افزایش ایمنی بدن می‌شود. این گروه برای انجام این تحقیقات، دو نوع رژیم غذایی را بر روی موش‌ها آزمایش کردند که یکی سرشار از BLG با غلظت زیاد و دیگری حاوی پروتئین‌های کازئین به جای BLG بود. این گروه دریافتند که پاسخ ایمنی بدن در موش‌هایی که رژیم غذایی آن‌ ها سرشار از BLG بود افزایش چشمگیری داشته است. همچنین این گروه با انجام یک سری آزمایش‌هایی بر روی پروتئین‌های شیر که دناتوره نشده‌اند، دریافتند که بالاترین پاسخ دستگاه ایمنی بدن هنگامی است که پروتئین‌های شیر به صورت طبیعی و با بالاترین حلالیت باشند (Bounous, Mark et al. ۱۹۸۸). همچنین قطعات پپتیدی ۱۰۵-۱۰۲، ۱۴-۹ و ۱۰۰-۴۹ در این پروتئین دارای خاصیت ضدفشارخونی^[۹۹] هستند که با نام کلی لاکتوکینین‌ها^[۱۰۰] شناخته می‌شوند و از هضم تریپسینی^[۱۰۱] یا تریپسینی/کیموتریپسینی^[۱۰۲] حاصل می‌شوند (Roufik, Gauthier et al. ۲۰۰۷).
به تازگی نیز شباهت توالی BLG به گلیکودلین بررسی شده است. گلیکودلین، لیپوکالینی است که به مقدار زیاد در سه ماهه اول حاملگی در رحم انسان تولید می‌شود. به همین دلیل پیشنهاد شده است که BLG نقش مهمی در رحم در اوایل حاملگی دارد (Kontopidis George et al. 2002).
۱-۳- خالص سازی^[۱۰۳]
۱-۳-۱- خالص سازی پروتئین
این واقعیت که پروتئین‌ها مواد مفیدی هستند به صورت همگانی پذیرفته نشده بود تا اینکه پس از سال ۱۹۲۶ جیمز سامنر^[۱۰۴] در ابتدا آنزیم اوره‌آز را به صورت بلور به دست آورد. در نیمه اول قرن بیستم روش‌های خالص‌سازی موجود برای پروتئین نسبت به اکنون بسیار خام و ساده بودند و خالص‌سازی پروتئین کار بسیار دشواری بود، اما به هر حال تا سال ۱۹۴۰ بیش از ۲۰ آنزیم در حالت خالص به دست آمدند. از آن به بعد ده‌ها هزار پروتئین در مقادیر متنوع خالص‌سازی و ویژگی ‌یابی شدند(Sodja 1996).
بخش عظیمی از تحقیقات بیوشیمیایی شامل خالص‌سازی با دقت بالای مواد می‌باشد، زیرا برای بررسی خواص فیزیکی-شیمیایی مواد خالص شده، آن‌ ها باید تا حدود زیادی بدون آلودگی باشند. البته این کار دشوار است، زیرا مواد موجود در مخلوط شباهت‌های بسیاری دارند. در صورتی که منابع متعددی پروتئین مورد نظر ما را به همراه داشته باشند، انتخاب یک منبع درست پروتئینی می‌تواند کار را بسیار آسان کند (Sodja 1996).
گام اول در جداسازی و خالص کردن یک مولکول پروتئینی، درآوردن آن به شکل محلول است. در مدت زمانی که در حال کار با پروتئین هستیم، ممکن است در معرض مواد مختلفی قرار بگیرد که این مواد می‌توانند پروتئین را به صورت غیر قابل برگشت تخریب کنند. این اثرات باید به دقت در تمامی مراحل فرایند خالص‌سازی کنترل شوند، در غیر این صورت مقدار پروتئین موجود به شدت کاهش یافته و یا از بین می‌رود (Sodja 1996).
توسعه و گسترش سانتریفوژهای یخچال‌دار، یک روش صاف کردن کارآمدتر را فراهم کرده‌است، اما هنوز هم برای حجم‌های زیاد روش صاف کردن ترجیح داده می‌شود، که در بسیاری از فرایند‌های خالص‌سازی جزء مراحل اولیه می‌باشد (Scopes 1994).
۱-۳-۲- خالص‌سازی BLG
پروتئین‌های اصلی آب پنیر، BLG و آلفالاکتالبومین هستند. این پروتئین‌ها ویژگی‌های تغذیه‌ای و عملکردی متعددی دارا می‌باشند که جهت کاربردهای صنعتی مانند افزودنی‌های غذایی، امولسیون‌^[۱۰۵]سازی و عوامل صابونی کردن و غیره استفاده می‌شوند. ولی فعالیت آن‌ ها که در حالت خالص بیشتر خواهد بود (Alomirah and Alli 2004, Vyas, Izco et al. ۲۰۰۲). برآورد شده است که BLG در صورتی که با هزینه پایین تولید شود، می‌تواند افزودنی خوراکی مفیدی باشد (Konrad, Lieske et al. ۲۰۰۰).
تغییر در ساختار طبیعی پروتئین باعث اثر گذاشتن بر روی خصوصیات عملکردی آن می‌شود، از این رو علاقه شدیدی به جداسازی^[۱۰۶] و خالص کردن بدون دناتوره شدن و از دست رفتن فعالیت زیستی BLG ایجاد شده است (Neyestani, Djalali et al. ۲۰۰۳). BLG به دلیل خصوصیاتی که دارد، به راحتی از شیر خالص‌سازی می‌شود. برای مثال BLG یکی از پروتئین‌های آب پنیر است که بیشترین مقاومت را به رسوب شدن در برابر تری‌کلرواستیک‌ اسید نشان می‌دهد (Fox KK, Holsinger et al. ۱۹۶۷). روش‌های بسیاری برای جداسازی BLG توصیه شده‌اند اما اغلب آن‌ ها عملی نیستند و تنها برای مصارف آزمایشگاهی قابل استفاده‌اند و هنوز ما نیازمند روشی هستیم که بتوان از آن برای حجم‌های بسیار زیاد استفاده کرد تا هزینه تولید این پروتئین کاهش یابد (Konrad et al. 2000).
اولین بار در سال ۱۹۳۴، پالمر^[۱۰۷]، جداسازی BLG را از شیر، و بلوری کردن آن را گزارش کرد. از آن زمان تا کنون پیشرفت‌های بسیاری در روش‌های خالص سازی صورت گرفته است و تنها زمان‌بر بودن این روش‌ها است که همچنان باقی است (Fox KK et al. 1967).
BLG به طور معمول با بهره گرفتن از روش پالمر خالص‌سازی می‌شود (Palmer 1934) ، که البته گاهی با تغییراتی همراه است و اساس آن دیالیزهای مشقت‌بار بخش لاکتالبومین جدا شده توسط فرایندهای خارج‌سازی از محلول^[۱۰۸] است. بخش لاکتالبومین ‌دارای یک پروتئین اصلی دیگر آب پنیر نیز به نام آلفالاکتالبومین می‌باشد (Gordon and Semmett 1953).
دیده شده است که خارج نکردن کامل بتالاکتوگلوبولین از محلول در بلوری شدن آلفالاکتالبومین در مراحل بعدی تداخل ایجاد می‌کند (Gordon and Ziegler 1955). همچنین مشخص شده است که آلفالاکتالبومین تمایل به ایجاد تداخل در تشکیل بلورهای بتالاکتوگلوبولین دارد و خالص شدن آن‌ ها را تحت تاثیر قرار می‌دهد (Aschaffenburg and Drewry 1957). بنابراین جداسازی کامل این دو پروتئین در مراحل اولیه، خالص‌سازی بسیار بهتری را فراهم می‌کند. زویگ^[۱۰۹] و همکاران، تلاش کردند که این دو پروتئین را پس از رسوب با کلریدآهن از هم جدا کنند، اما موفق به جداسازی بسیار ضعیفی شدند و میزان کمی آلفلاکتالبومین خالص شده را به دست آورند (Zweig and Block 1954). از این رو یکی از فاکتورهای مهم یک روش خوب خالص‌سازی می‌تواند جداسازی BLG و آلفالاکتالبومین از یکدیگر باشد.
یکی از بهترین روش‌های خالص سازی BLG روش آشافنبرگ^[۱۱۰] و همکاران است که با رساندن pH آب پنیر حاوی به ۲ ، آلفالاکتالبومین و سرم‌آلبومین و به میزان کمی BLG رسوب می‌کند و BLG را به صورت محلول باقی می‌گذارد. البته این روش مشکلاتی هم دارد، مانند در دسترس نبودن بی‌آب. همچنین دمای ۴۰ موجو در این روش غیر ضروری است. بتالاکتوگلوبولین در pH بالای ۹ نیز به صورت برگشت‌ناپذیر دناتوره می‌شود، بنابراین در خالص سازی این پروتئین محدوده pH و دما باید به دقت رعایت شود(Aschaffenburg and Drewry 1957).
۱-۳-۳- انواع روش‌های خالص سازی BLG
روش‌های متعددی برای خالص سازی BLG می‌توان به کار برد از جمله آن‌ ها خارج سازی از محلول (Aschaffenburg and Drewry 1957)، رسوب‌دهی انتخابی (Amundson, Watanawanichakorn et al. ۱۹۸۲)، رسوب دادن به وسیله تری‌کلرواستیک اسید (Fox KK et al. 1967)، گرما دادن در pH پایین (Pearce 1983)، کروماتوگرافی تمایلی^[۱۱۱] (Bläckberg and Hernell 1980)، کروماتوگرافی تعویض آنیونی^[۱۱۲] (Gerberding and Byers 1998, Skudder 1985)، کروماتوگرافی تعویض کاتیونی^[۱۱۳] با بهره گرفتن از رزین‌های کووالانت (Uchida, Sato et al. ۱۹۹۶)، کروماتوگرافی اندازه‌ای (Hill, Irvine et al. ۱۹۸۶)، کروماتوگرافی هیدروفوبی^[۱۱۴] (Chaplin 1986)، و ترکیب تیمار آنزیمی^[۱۱۵] و صاف کردن (Kinekawa and Kitabatake 1996) را می‌توان نام برد.
۱-۳-۳-۱-روش خارج‌سازی از محلول
۱-۳-۳-۱-۱- روش آشافنبرگ و همکاران
آشافنبرگ و همکاران از روش خارج کردن از محلول برای خالص سازی این پروتئین استفاده کردند. آن‌ ها این اعتقاد را داشتند که جداسازی اولیه بتالاکتوگلوبولین و آلفالاکتالبومین نتیجه بهتری را در پایان فرایند خالص‌سازی فراهم می‌کند. این روش از لحاظ سادگی و نتیجه نهایی یکی از بهترین روش‌ها است که اصول کلی آن به شرح زیر می‌باشد:
شیر تمیز را ابتدا آماده کرده و آن را به دمای ۴۰ رسانده و بی‌آب () را همراه با هم زدن اضافه نموده. پس از اینکه نمک به صورت کامل حل شد و اجازه داده شد که دما به زیر ۲۵ برسد، مخلوط را با بهره گرفتن از کاغذ صافی، صاف کرده که ماده صاف شده دارای لاکتالبومین است و رسوب حاوی گلوبولین‌ها و جربی و غیره می‌باشد. حجم ماده صاف شده را اندازه‌گیری کرده و HCl ( )را با تکان دادن شدید به مخلوط می‌افزاییم. افزودن HCl را تا آن‌جا ادامه داده که pH به زیر ۲ برسد و باعث رسوب سریع تمامی پروتئین‌ها به جز BLG شود. در این مرحله اگر محلول به حال خود رها شود، تمایل به رسوب پیدا می‌کند و باید توسط حرارت دادن مجدد، دوباره حل شود، زیرا غلظت آن در مرحله بعدی خارج سازی BLG از محلول مورد نیاز است. رسوب در این مرحله را با سانتریفوژ دور بالا از محلول می توان جدا کرد، گرچه رسوب به خوبی تجمع پیدا نمی‌کند و جهت به دست آوردن رسوب به میزان کافی باید آن را صاف کرد. اکنون می‌توان با پروتئین‌های جدا شده به صورت مستقل کار کرد. BLG را که اکنون در محلول وجود دارد، با () می‌توان رسوب داد (Aschaffenburg and Drewry 1957).
در واقع مزیت اصلی این روش، جداسازی BLG و آلفالاکتالبومین در مراحل اولیه از طریق یک اسیدی کردن ساده است که اجازه می‌دهد تا به صورت هم‌زمان یا جداگانه مورداستفاده قرار گیرند (Aschaffenburg and Drewry 1957).
۱-۳-۳-۱-۲- روش آرمسترانگ^[۱۱۶] و همکاران
در این روش به دلیل دسترسی آسان‌تر، به جای نمک موجود در روش آشافنبرگ و همکاران که است، از استفاده می‌شود. و دمای ۴۰ غیر ضروری حذف شده است. این روش به صورت کلی به شکل زیر است:
به شیرخام آمونیوم‌سولفات^[۱۱۷] را در دمای ۲۰ اضافه کرده و مخلوط را برای مدت زمان ۲ ساعت به حال خود رها نموده. سپس با بهره گرفتن از کاغذ صافی واتمن^[۱۱۸](cm20( مخلوط را صاف کرده. رسوب باقی مانده را دور ریخته و pH محلول آب‌پنیر ( ) را به ۵/۳ رسانده که این کار را با افزودن HCl M1 انجام می‌دهیم. پس از مدت زمان ۱ ساعت محلول را سانتریفوژ نموده. رسوب این مرحله (a2) حاوی آلفالاکتالبومین است و در صورت نیاز نگه‌داری می‌شود، و باید pH آن توسط آمونیاک به ۷ برسد. اما محلول به دست آمده با M1 به pH ۶ رسانده می‌شود و دوباره مقداری آمونیوم سولفات به محلول افزوده می شود تا BLG رسوب کند. مخلوط را یک شبانه روز در دمای ۲ ۲۰ به حال خود رها می‌کنیم. سپس به مدت ۳۰ دقیقه سانتریفوژ می‌شود. رسوب را جمع‌ آوری کرده و دوباره در دور بالاتر سانتریفوژ صورت می‌گیرد. محلول را دور ریخته و رسوب را در بافر استات حل کرده. سپس به مدت ۲۴ تا ۲۸ ساعت تحت دیالیز قرار می‌گیرد. پروتئین را قبل از خشک کردن با خلاء در دمای پایین در ۸۰- و پس از خشک شدن در دمای۲۰- نگه داری می‌شود (Armstrong, McKenzie et al. ۱۹۶۷).
۱-۳-۳-۲ -خالص‌سازی برای حجم‌های بالا
برای این روش به جای شیر می‌توانیم از ^[۱۱۹]WPI و ^[۱۲۰]WPC استفاده کنیم. به دلیل توان استفاده از حجم‌های بالا این روش یک روش صنعتی است و طرفداران ویژه خود را دارد. این روش می‌تواند با بررسی‌های بیشتر کارایی بالاتری پیدا کرده و به شیوه‌های ساده‌تری نیز تبدیل شود.
WPI و WPC را تا به دست آمدن غلظت در آب حل کرده. سپس با بهره گرفتن از سدیمسیترات^[۱۲۱] یا سدیم‌هگزامتافسفات^[۱۲۲] ۱.۵۰)) تیمار می‌شوند و سپس با اسید سیتریک N6 به pH 9/3 رسانده می‌شوند. اکنون در دمای ۳۵ به مدت ۴۰ دقیقه نگه‌داری می شود. مخلوط حاصل را به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۴ در دور g5000 سانتریقوژ کرده که این مرحله جهت رسوب آلفالاکتالبومین در حالت آپوآلفالاکتالبومین بدون کلسیم صورت می‌گیرد. محلول و رسوب مرحله قبل با NaCl 7% شسته شده و در دور g10000 و دمای ۴ به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ می‌شوند. اکنون محلول مرحله قبل را ۲۴ ساعت در برابر آب دوبار تقطیر^[۱۲۳] دیالیز^[۱۲۴] نموده. این محلول حاوی BLG است، که پس از خشک کردن با خلاء در دمای پایین^[۱۲۵] می‌توان آن را به شکل پودر درآورد (Alomirah and Alli 2004).
۱-۳-۳-۳- خالص‌سازی با تری‌کلرواستیک اسید (TCA)
BLG به دلیل این‌که بسیار به رسوب تری‌کلرو استیک اسید مقاوم است، به راحتی می‌تواند از شیر جدا شود. پس می‌توان کازئین را حذف اسیدی کرده و بقیه پروتئین‌ها را هم با تری‌کلرو استیک اسید حذف کرد تا تنها BLG در محلول باقی بماند. این روش که بر اساس یک ویژگی‌های منحصربه‌ فرد BLG بنا شده است، مزیت اصلیش کاهش تعداد مراحل آزمایش است که خالص‌سازی را بسیار آسان کرده است. مراحل انجام این روش به شکل زیر است:
pH شیر خام را توسط HCl () به ۷/۴ رسانده می‌شود. در این حالت شرایط رسوب کازئین فراهم شده است و کازئین به راحتی رسوب می‌کند. پس از چند ساعت که واکنش کامل انجام شد مخلوط دارای pH ۷/۴ را صاف می‌کنیم تا کازئین رسوب کرده را خارج کنیم. مقداری TCA در آب حل شده را به آرامی در محلول باقی مانده حل نموده که این کار همراه با هم زدن^[۱۲۶] خواهد بود. پس از افزودن تری‌کلرواستیک اسید، مخلوط را ۳۰ دقیقه به حال خود رها کرده، که در این مرحله تمامی پروتئین‌ها به غیر از BLG رسوب خواهند کرد. رسوب‌ها را با سانتریفوژ از مخلوط جدا کرده و محلول به دست‌آمده را که دارای BLG خالص می‌باشد را جهت تغلیظ بیشتر تحت دیالیز منفی قرار می‌دهیم. از این مرحله به بعد جهت به دست آوردن رسوب خالص BLG دو روش را می‌توان در دستور کار قرار داد. اول این‌که می‌توان با افزودن آمونیوم سولفات به محلول باعث رسوب آن شد، و یا اینکه دیالیز را در برابر آب دوبار تقطیر آنقدر ادامه داد، تا در اثر افزایش بیش از حد غلظت رسوب حاصل شود. این روش علاوه بر سادگی به دلیل انتخابی بودنش بر اساس ویژگی خاص BLG اهمیت ویژه‌ای دارد (Fox KK et al. 1967).
۱-۳-۳-۴- خالص‌سازی با بهره گرفتن از هضم پپسینی
تفاوت حلالیت در حضور آمونیوم‌سولفات، جداشدن BLG و آلفالاکتالبومین را در pH ۲ ممکن می‌سازد، اما روش‌های دیگری نیز جهت جداسازی این دو پروتئین وجود دارد. برای مثال BLG طبیعی نسبت به هضم پپسینی و کیموتریپسینی مقاوم است در حالی که آلفالاکتالبومین نسبت به این آنزیم‌ها حساس است. با بهره گرفتن از این اختلاف می‌توان به جداسازی این دو پروتئین پرداخت که به روش‌های مختلفی این کار انجام شده است (Kinekawa and Kitabatake 1996).
در این روش ابتدا pH آب‌پنیر را با بهره گرفتن از HCl N2به ۲ رسانده می‌شود. سپس محلول را در دمای ۳۷ به مدت ۱۰ دقیقه نگه‌داری کرده. واکنش آنزیمی را در همین دمای ۳۷ ترتیب داده، که در آن نسبت پروتئین به آنزیم ۲۰۰ به ۱ خواهد بود. پس از انجام شدن تیمار آنزیمی، بخش‌های پروتئینی با آمونیوم‌سولفات جمع‌ آوری شده و دیالیز می‌شوند که با بهره گرفتن از صاف کردن بسیار دقیق (با صافی‌های دارای منافذ ۳۰-۲۰ کیلو دالتنی^[۱۲۷]) BLG را می‌توان جدا نمود (Kinekawa and Kitabatake 1996).
۱-۳-۳-۵- خالص سازی با بهره گرفتن از کروماتوگرفی تعویض یونی
یکی از دقیق‌ترین روش‌ها استفاده از شیوه کروماتوگرافی است که حساسیت بالایی دارد، اما این شیوه هزینه بالاتری نسبت به دیگر روش‌ها دارد و صرفاّ جهت کارهای آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد و برای مصارف صنعتی و حجم‌های زیاد غیر قابل استفاده است. این روش بدین صورت است که:
دی‌متیل‌آمینو‌اتیل تویوپیرل^[۱۲۸] (DEAE-TP) را جهت کروماتوگرافی یونی آماده کرده. کروماتوگرافی با بهره گرفتن از ستون cm 18 cm 5/1 از DEAE-TP انجام می شود. آب‌ پنیر از قبل تهیه شده از ستون عبور داده می‌شود و پس از انجام این مرحله ستون را با بافر تریس-HCl^[129] M ۰۵/۰ که دارای pH ۵/۸ است شست و شو صورت می‌گیرد، که در این ستون آلفالاکتالبومین خارج شده و BLG جذب ستون می شود (Ye, Yoshida et al. ۲۰۰۰).
۱-۳-۳-۵- خالص‌سازی با بهره گرفتن از رسوب‌دهی انتخابی
برای به کار بردن این روش در ابتدا باید حذف یونی^[۱۳۰] از محلول و غلیظ‌سازی اولیه از محلول صورت پذیرد. پس از انجام موارد فوق با بهره گرفتن از صاف‌کردن بسیار دقیق، امکان حذف جزیی آب، نمک و لاکتوز فراهم می‌شود. محلول حاصل را به pH ۶۵/۴ رسانده، که این کار با بهره گرفتن از HCl انجام می‌شود. در مرحله بعدی محلول دارای pH ۶۵/۴ را تحت دیالیز الکتریکی قرار داده تا یون‌های ، ، و غیره حذف شوند. آب پنیر حذف یونی شده را دوباره به pH ۶۵/۴ برگردانده تا رسوب BLG حاصل شود. رسوب تشکیل شده را با بهره گرفتن از سانتریفوژ جدا کرده و جهت خشک کردن در دمای پایین آماده می‌کنیم (Amundson et al. 1982).
۱-۴- تغییرات پروتئینی^[۱۳۱]
۱-۴-۱- مقدمه
پروتئین‌ها در معرض تغییرات پروتئینی بسیاری، هم در گروه‌های عملکردی و هم در زنجیره‌های جانبی قرار دارند. بیش از ۱۵۰ نوع تغییر زنجیره جانبی، شامل تمامی زنجیره‌های جانبی Ala، Gly، Ile، leu، Met و Val شناخته شده‌اند. این تغییرات شامل استیل‌دار شدن^[۱۳۲]، متیل‌دار شدن^[۱۳۳]، نوکلئوتیددار شدن^[۱۳۴]، فسفردار شدن^[۱۳۵] و ADP-ریبوزدار شدن^[۱۳۶] می‌باشد (Sodja 1996).
برخی تغییرات پروتئینی مانند فسفردار شدن گلیکوژن‌فسفریلاز^[۱۳۷] و ADP-ریبوزدار شدن eEF2 فعالیت پروتئین را تغییر می‌دهند. بسیاری از تغییرات زنجیره جانبی به صورت کووالان به کوفاکتورهای^[۱۳۸] آنزیم‌ها، جهت افزایش قدرت کاتالیزوری به‌ آن‌ ها متصل می‌شوند. مثال‌های کوفاکتورهای متصل شده، N-لیپولیزین^[۱۳۹] در دی‌هیدرولیپوئیل‌ترانس‌استیلاز^[۱۴۰] و ۸آلفا-هیستیدیل‌فلاوین^[۱۴۱] در سوکسینات‌دهیدروژناز^[۱۴۲] می‌باشد. اتصال کربوهیدرات‌های پیچیده، خصوصیات ساختاری پروتئین‌ها را تغییر می‌دهد و نشانگرهای شناسایی^[۱۴۳] را در بر‌هم‌کنش‌های هدف گیری^[۱۴۴] و سلول به سلول تشکیل می‌دهد. تغییراتی که باعث اتصال عرضی پروتئین‌ها می شود (مانند کلاژن)، تجمعات ابرمولکولی^[۱۴۵] را پایدار می‌کند. عملکرد اغلب تغییرات زنجیره جانبی باید مشخص شود (Sodja 1996).
تغییرات پروتئینی می‌توانند آنزیمی و غیر آنزیمی باشند که از مهم‌ترین آن‌ ها می‌توان به فسفردار شدن و قند دار شدن اشاره کرد.
۱-۴-۲- فسفردار شدن
فسفردار شدن پروتئین اولین بار در سال ۱۹۵۵ شناسایی شد و از آن پس بود که مشخص شد فسفردارشدن یک فرایند تنظیمی است (Derouiche, Cousin et al. ۲۰۱۲).
مسیرهای فسفردار شدن پروتئینی در قالب شبکه بزرگ و متقاطعی شامل پروتئین‌کینازهای^[۱۴۶] فعال دوطرفه، کینازهای فعال به عنوان مراکز شبکه با فسفردار کردن پیش ماده‌های مختلف و تقاطع فسفردار شدن با دیگر تغییرات پس ترجمه‌ای در نظر گرفته می‌شود (Derouiche et al. 2012).
موجودات زنده فعالیت‌های سلولی خود را با محرک‌های مختلف از پیام‌های محیطی گرفته تا پیام‌های درگیر در تمایز سلولی و تنظیم‌ها سازگار می‌کنند. فعالیت‌های سلولی توسط اثر شکل فعال پروتئین در سلول تنظیم می‌شوند. این کار می‌تواند توسط تنظیم رونویسی ژن انجام شود که یک فرایند به طور نسبی کند می‌باشد، زیرا شامل تولید از ابتدای^[۱۴۷] پروتئین است (Chechik and Koller 2009). یک پاسخ سریع‌تر، پروتئین‌های حاضر در سلول هستند که می‌توانند بین شکل فعال و غیر فعال از طریق تغییرات برگشت‌پذیر کووالانسی یا اتصال تنظیم کننده‌های آلوستریک^[۱۴۸] تغییر شکل دهند، که هر دوی این روش‌ها برگشت‌پذیرند (Deribe, Pawson et al. ۲۰۱۰, Shen 2010). در میان تغییرات کووالانسی پس از ترجمه، فسفردار شدن فرایندی است که بیشتر بررسی شده است (Hunter 1995). از گذشته فسفردار شدن بسیار مورد توجه بوده است و به عنوان فراوان‌ترین تغییر پس از ترجمه^[۱۴۹] در نظر گرفته می‌شود (Krüger, Kübler et al. ۲۰۰۶)، اگرچه بررسی‌ها نشان می‌دهد که دیگر تغییرات پس از ترجمه‌ای نیز فراوانی چشم‌گیری دارند (Choudhary and Mann 2010).
فسفردار شدن پروتئین‌ها می‌تواند نقش‌های متفاوتی در چرخه سلولی (Correia, Alonso-Monge et al. ۲۰۱۰)، فعالیت پروتئین سرکوب کننده سرطانی ۵۳P (MacLaine and Hupp 2011) و در ریتم شبانه روزی پستانداران (Leloup and Goldbeter 2011) و مرگ برنامه ریزی شده سلولی داشته باشد (Kitazumi and Tsukahara 2011).