فیروزآبادی و همکاران (Firoozabadi et al, ۱۹۹۵) توانایی تراریزشی بافت های گیاهی توسط سویه های EHA 101، A281 و LBA 4404، A. tumefaciens و سویه ۱۵۸۳۴، A. rhizogenes را مورد بررسی قرار دادند. سویه EHA 101 (به دست آمده از سویه A281) حاوی ناقل دوتایی PSLJ1911 در اثر هم کشتی^[۴۱] با ریزنمونه های ساقه میخک ارقام ’ʻImproved White Sim‘،’ Manon‘،’ Sondra‘،’ Bordeaux‘ و ’ Kopo Reve‘ منجر به بیان GUS بالایی شد. بنابراین EHA 101 در همه آزمایش های تراریزشی استفاده شد. فیروزآبادی و همکاران (Firoozabadi et al, ۱۹۹۵) نشان دادند که باززایی شاخساره ها از ریزنمونه های پایه برگ روی محیط کشت حاوی نمک های MS همراه با ۵/۰ میلی گرم در لیتر IBA، ۲۲/۰ میلی گرم در لیتر TDZ، ۳۰ گرم در لیتر سوکروز، ۵۹۰ میلی گرم در لیتر متیل اتان سولفونات و ۵/۲ گرم در لیتر جلرایت بسیار سریع بود. به هر حال شاخساره های باززایی شده پس از هم کشتی دارای بافت ناهمسان بودند. ایجاد بافت ناهمسان ممکن است به علت منشأ مریستم شاخساره جدید چند یاخته ای باشد. آن ها به منظور کاهش تلاقی و گسترش بافت ناهمسان روش باززایی را به باززایی تأخیری بهبود بخشیدند. بنابراین اجازه تقسیم یاخته ای اضافی و تشکیل پینه پیش از سازماندهی یک مریستم جدید را دادند. این کار با بهره گرفتن از یک ترکیب هورمونی متفاوت، با جایگزینی BA بجای TDZ و IBA با ۲,۴-D امکان پذیر است (Firoozabadi et al, ۱۹۹۵).

۲-۲-۳-۱-۳- چگالی نوری

برای مایه کوبی^[۴۲] سوسپانسیون باکتریایی را آنقدر رقیق و یا غلیظ می نمایند تا OD آن در ۶۰۰ نانومتر به حدی برسد که اجازه انتقال کارآمد به یاخته گیاه میزبان را بدهد. به طور معمول ۶۰۰OD بین ۵/۰ تا ۱ برای مایه زنی مواد گیاهی استفاده می شود (Dai et al, 2001). به هرحال، در برخی بررسی ۶۰۰OD بیش از ۱ استفاده شده است.
در پژوهشی برای مایه زنی ریزنمونه های لپه و محور زیر لپه گل استکانی^[۴۳] از ۶۰۰OD 5/2-2 استفاده گردید (Sriskandarajah et al, 2004). در این پژوهش نشان داده شد که برای مایه زنی ریزنمونه به غلظت باکتری زیادی در طول هم کشتی نیاز است.

۲-۲-۳-۱-۴- انگیزاننده های ژن های بیماری زا

ژن های بیماری زا تعدادی پروتئین را کد می نمایند که نقش اساسی در فرایند تراریزشی با اگروباکتریوم بازی می کنند. استوسیرینگون یک ترکیب فنولی مترشحه به وسیله یاخته های گیاهی زخم شده می باشد، که به عنوان یک عامل تحریک کننده ژن های بیماری زای اگروباکتریوم شناخته می شود (Stachel et al, 1985). استوسیرینگون در دمای زیر ۲۸ درجه سلسیوس،‌ سوکروز و pH اسیدی برای بیان VirG و VirD در نواحی Vir از پلاسمید Ti موثر هستند (Stachel et al, 1985).
گروچلا و همکاران (Gruchala et al, 2004) بیان نمودند زمانی که گیاهان توت فرنگی با A. tumefaciens در محیط LB یا MS با استوسیرینگون و IAA هم کشت شدند موجب افزایش در تعداد شاخساره های تراریخت گردید. به هر حال بعضی از پژوهش ها اثر ممانعت کننده (Orlikowska et al, 1995) یا خنثی (Miguel and Oliveira, 2003) استوسیرینگون بر کارآیی تراریزشی گیاهان را گزارش کردند. در پژوهشی برکارایی انتقال ژن به لپه های لوبیا با سویه بیش از حد بیماری زای EHA نشان داده شد که استوسیرینگون تاثیر آشکاری بر انتقال ندارد. به هر حال، اثر استوسیرینگون روی کارایی انتقال وقتی که یک سویه با بیماری زایی متوسط استفاده شد، به دست آمد (Nadolska and Orczyk, ۲۰۰۰). نانتاسواتسری و همکاران (Nontaswatsri et al, 2003)‌ اثرات محیط هم کشتی بر انتقال را مورد بررسی قرار دادند و بیان نمودند که ریزنمونه های تک گره میخک هم کشتی شده در محیط محتوی آب و استوسیرینگون نسبت به ریزنمونه های هم کشت شده با آب بیان GUS بالاتری داشتند.
این نتایج نشان می دهد اگر چه افزودن استوسیرینگون در مرحله هم کشتی انتقال ژنتیکی را بر می انگیزد، ولی افزودن غلظت های بیشتر استوسیرینگون میزان های انتقال بالاتری را سبب می شود.
آن ها همچنین بیان داشتند که وجود فیتوهورمون ها و مواد غذایی در طول هم کشتی برای به دست آوردن انتقال ژن کارآمد و بیان ژن با پایداری بالا نیازی نیست. اگر چه افزودن استوسیرینگون در مرحله مایه کوبی انتقال ژنتیکی را تحریک می نماید، ولی افزودن بیشتر آن در مرحله هم کشتی نسبت به افزودن آن تنها در مرحله مایه کوبی میزان های انتقال بیشتری را باعث می شود. ترکیب های فنولی گیاه مانند استوسیرینگون می توانند الحاق باکتری به گیاه میزبان و میزان انتقال را افزایش دهند. به هر حال هم کشتی روی محیط MS حاوی فیتوهورمون بدون حضور شکر و استوسیرینگون سبب افزایش انتقال نمی شود (Nadolska and Orczyk, ۲۰۰۰).

۲-۲-۳-۱-۵- مدت زمان هم کشتی

پس از مایه زنی، ریزنمونه ها روی محیط جامد مناسب به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت برای اجازه انتقال DNA و الحاق به یاخته های گیاهی نگهداری می شوند. به هر حال، طول مدت هم کشتی در گونه های گیاهی مختلف متفاوت است.
به طور معمول طول دوره هم کشتی ریزنمونه ها با Agrobacterium از ۲ (Cho et al, 2001) تا ۷ روز (Jia et al, 1989) متغیر است. در زغال اخته آبی^[۴۴] ریزنمونه های هم کشتی شده به مدت ۲ روز با باکتری بیان GUS نشان ندادند. به طور کلی دستکم ۳ تا ۴ روز هم کشتی برای انتقال کارآمد ژن بتاگلوکورونیداز به درون ریزنمونه های برگ نیاز بود (Cao et al, 1998).
در پژوهش های نخستین با سویه EHA 101، A. tumefaciens برای انتقال ژن به ارقام ’Improved White Sim‘،’Manon‘،’Sandra‘،’ ‘Nathalie، ’ ‘Bordeaux و
’Kopo Reve‘ نشان داده شد که یک دوره هم کشتی ۵ روزه با غلظت ۱۰^۵×۱-۵/۰یاخته در میلی لیتر برای انتقال ژن به پایه های برگ میخک مناسب است (Lu et al, 1991).

۲-۲-۳-۱-۶- گزینش با کانامیسین

آنتی بیوتیک ها به طور گسترده در فناوری انتقال ژن برای گزینش بافت های تراریخت و یا برای حذف اگروباکتریوم از کشت ها زمانی که وجود آن ها دیگر نیازی نیست، استفاده
می شوند. حذف اگروباکتریوم از کشت ها مهم است، زیرا آلودگی های میکروبی در گیاهان کشت شده می تواند پرآوری و میزان ریشه دهی را کاهش داده و یا منجر به مرگ گیاه شود (Chawla, 2000). به هر حال حذف اگروباکتریوم در گیاهان تراریخت یک پیش نیاز در جلوگیری از احتمال آزادسازی ژن وقتی که این گیاهان به خاک منتقل شدند، می باشد (Altvorst et al, 1994).
کانامیسین یکی از گسترده ترین عامل های گزینشگر برای تشخیص گیاهان تراریخت است. ژن npt II، آمینوگلیکوزید ۳- فسفو ترانسفراز II را کد می کند. این آنزیم تعدادی از آنتی بیوتیک های گلیکوزیدی مانند کانامیسین، نئومایسین، جنتایسین (G418) و پرومایسین را غیرفعال می سازد (Chawla, 2000). به هرحال شدت گزینش شاخساره های تراریخت با این آنتی بیوتیک به گونه وابسته است. آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی نظیر کانامیسین با اتصال به جزء ۳۰S ریبوزوم های باکتری سبب مهار دایمی پروتیئن سازی شده و باکتری کش هستند. کانامیسین با غلظت ۵۰ تا ۵۰۰ میلی گرم در لیتر از متداول ترین عوامل گزینشگر مورد استفاده می باشد.
فصل سوم

۳- مواد و روش‌ها

۳-۱- کشت بافت

۳-١-۱- مواد گیاهی

برای انجام پژوهش از یک رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ و یک رقم مینیاتور’Panamera‘ استفاده شد. این ارقام از گلخانه‌ای واقع در شهرستان محلات تهیه و پس از قلمه‌گیری در گلخانه بخش علوم باغبانی دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز نگهداری شدند. گیاهان در محیط دارای پیت، پرلایت و خاک باغچه با نسبت برابر کشت شده و با محلول غذایی راساسول ایون^[۴۵] (۲ در هزار، هر ۳۰ روز یک بار) تغذیه می شدند. همچنین آبیاری با دقت صورت گرفت. زمانی که آزمایش شروع شد گیاهان ۶ تا ٨ هفته عمر داشتند.

۳-١-۲- قسمت‌های گیاهی مورد استفاده در کشت بافت

ریزنمونه‌های مورد استفاده در کشت بافت از قسمت‌های مختلف برگ یا گلبرگ تهیه شد. قطعه های برگ جوان که بیش از ٨٠% رشد نهایی را یافته و قطعه های گلبرگ گیاهان گلدار دارای گل‌های باز شده یا باز نشده به کار گرفته شد. ١۵ روز پیش از تهیه ریزنمونه‌ها، گیاهان با سموم قارچ‌کش بنومیل و مانکوزب به غلظت ۲ در هزار و کود اوره ۴۶% به میزان ٢ گرم در هر گلدان تیمار شدند.

۳-١-٣- گندزدایی ریزنمونه‌ها و وسایل

قطعه های جدا شده از گیاهان مادری بسته به نوع (برگ یا گلبرگ) به مدت ١٠ دقیقه درون آب حاوی چند قطره مایع ظرف‌شویی به عنوان مویان و سپس٣٠ تا ۴۵ دقیقه زیر آب جاری قرار داده شدند. در این مدت اتاقک جریان هوا^[۴۶] با الکل ٧٠% ضدعفونی و روشن گردید. همچنین تمامی وسایل مورد نیاز برای گندزدایی شامل ظروف شیشه‌ای، آب مقطر، پنس، چاقوی آزمایشگاهی و سایر وسایل به مدت ٣٠ دقیقه در اتوکلاو با دمای ١٢١ درجه سلسیوس و فشار ۵/١ کیلوگرم بر سانتی‌مترمربع سترون شدند. سپس در زیر دستگاه جریان هوا وسایل سترون شده به مدت دستکم نیم ساعت در برابر نور فرابنفش^[۴۷] برای اطمینان از گندزدایی کامل قرار گرفتند.
قطعه های گیاهی شستشو شده در آب جاری به زیر دستگاه جریان هوا منتقل و در آنجا، بسته به نوع ریزنمونه به مدت ٣٠ تا ۴۵ ثانیه در اتانول ٧٠% و سپس به مدت ١٠ تا ١۵ دقیقه در محلول ١٠% هیپوکلریت سدیم تجاری برای گندزدایی سطحی فرو برده شدند. تمامی ریزنمونه‌ها پس از پایان این مدت، ۵ مرتبه در مدت دستکم ٢٠ دقیقه با آب مقطر سترون شستشو و آماده انتقال به محیط کشت شدند.

۳-١-۴- آماده‌سازی ریزنمونه‌ها برای استقرار

پس از گندزدایی سطحی قطعه های گیاهی، ریزنمونه‌های برگ به ابعاد ۵/۰ تا ۱ سانتی متر مربع و ریزنمونه‌های گلبرگ به صفحه‌های ١٠ تا ۳٠ میلی‌متر مربعی بریده و آماده کشت شدند.

۳-١-۵- محیط کشت

برای رسیدن به اهداف مختلف ریزافزایی این ارقام، محیط کشت MS (جدول ۳-۱) به کار رفت. در این محیط کشت، انواع و غلظت­های متفاوتی از تنظیم کننده­ های رشد گیاهی استفاده شد. برای تهیه آن، سوکروز به مقدار ۳۰ گرم در لیتر و آگار به میزان ۸ گرم در لیتر به عنوان غلظت پایه مورد استفاده قرار گرفتند. پس از افزودن همه ترکیب­های محیط کشت (به جز آگار) و رساندن به حجم مورد نظر با آب دوبار تقطیر شده، واکنش (pH) محیط کشت با بهره گرفتن از سود نرمال و یا کلریدریک اسید نرمال، در محدوده ۸/۵-۷/۵ تنظیم شد. سپس آگار اضافه گردید و ظرف حاوی محیط کشت برای ذوب شدن آگار به گونه ­ای که محیط کشت شفاف گردد، با بهره گرفتن از هم زن گرما دار^[۴۸] گرم شد و در نهایت، ۱۰ میلی­لیتر محیط کشت به هر پتری دیش منتقل شد.
محیط کشت آماده شده به مدت ١۵ دقیقه در اتوکلاو با دمای ١٢١ درجه سانتی‌گراد و فشار ۵/١ کیلوگرم بر سانتی‌مترمربع سترون شدند. محیط کشت سترون شده در زیر دستگاه جریان هوا به سرعت درون ظروف شیشه‌ای یا پتری دیش‌های سترون مخصوص کشت ریخته و خنک شدند. سپس ریزنمونه‌ها درون ظروف مربوطه کشت شده و در شرایط ١۶ ساعت روشنایی در شبانه روز، دمای ٣ ٢۶ درجه سانتی‌گراد و شدت نور ١٠٠٠ لوکس قرار گرفتند.
جدول ۱-۳- مواد تشکیل دهنده محلول­های پایه محیط کشت MS.