فهرست مطالب

عنوان                       صفحه

فصل اول: کلیات.. 1

1-1-تاریخچه وطبقه بندی: 2

1-2-مشخصات میکروسکوپی و ماکروسکوپی: 4

1-3- کشت: 4

1-4-آنتی ژنها وعوامل بیماریزایی.. 5

1-4-1-عوامل اتصالی فیمبریه ای: 7

1-4-2-سایرعوامل بیماریزائی: 10

1-5-بیماریها و عوارض…. 11

1-6- روش‏های تشخیص کلاسیک: 13

1-7-اپیدمیولوژی.. 14

1-7-1-جلوگیری از پنومونی.. 14

فصل دوم: پیشینه پژوهش… 16

2-1- مقدمه. 17

2-2- تاریخچه. 18

فصل سوم: روش شناسی.. 21

3-1- مواد و وسایل: 22

3-2- دستگاه ها: 24

3-3- محلول سازی: 25

3-3-1- آماده سازی محیط کشت: 25

3-3-2- محیط شکلات اگار: 26

3-3-3- آماده سازی ژل اگارز 1 درصد: 27

3-4- طراحی و روش اجرا: 27

3-4-1- جمع‏آوری نمونه: 27

3-5- کشت نمونه ها: 27

3-6- تست ‌های بیوشیمیایی: 28

3-7- رنگ آمیزی: 29

3-8- نگهداری ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا در شرایط کرایو در دمای -80ْ: 29

3-9- استخراج DNA.. 30

3-9-1-استخراج DNA به روش جوشاندن: 30

3-10- بررسی کیفیت و کمیت DNAاستخراج شده: 30

3-11- راه اندازی و انجام PCR: 31

3-12- واکنشPCR.. 32

3-13- الکتروفورز محصول PCR: 35

3-13-1- مواد و وسایل مورد نیاز: 35

3-13-2- نحوه تهیه ژل اگارز و انجام الکتروفورز: 35

3-14- تفسیر ژل الکتروفورز. 36

3-15- RFLP.. 36

3-15-1- استخراج باند اصلی از روی ژل اگارز. 37

3-15-2- بررسی غلظت محصولات تخلیص شده توسط دستگاه نانودراپ: 37

3-16- مواد و وسایل لازم برای RFLP: 37

3-16-1- روش انجام RFLP باآنزیمAlu1: 38

3-16-2- انجامRFLP باآنزیم محدودالاثر EcoR1: 38

3-17- تعیین توالی و پردازش داده ها: 38

3-17-1- ارسال نمونه‏ها جهت توالی یابی قطعه تکثیر شده: 39

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها 40

4-1- تعداد نمونه‏ها و ایزولاسیون: 41

4-2-تستهای بیوشیمیایی: 42

4-3-نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده: 42

4-4- PCRژن ompP2 ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا: 43

4-5- RFLP: 44

4-6: نتایج تعیین توالی (Sequencing) و ثبت توالی‌ها دردیتابیسGeneBank/EMBL: 45

4-7- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی نمونه ها: 46

4-7-1- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 3: 46

4-7-2. آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 5: 47

4-7-3- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 8: 48

4-7-4- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 35: 49

4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 47: 50

4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره14: 51

4-8- بررسی میزان شباهت و تفاوت ایزوله‌های بالینی تهران: 52

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.. 56

5-1- آنالیز RFLP از ایزوله‌های بالینی: 57

5-2. آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 3: 57

5-2-1آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 5: 58

5-2-2- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 8: 58

5-2-3- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 35: 59

5-2-4- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 14: 60

5-2-5- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 47: 60

5-3- بحث: 61

پیشنهادات: 66

منابع. 67

فهرست منابع. 68

Abstract 75

پیوست ها 76

فهرست جداول

جدول3-1- مواد تشکیل دهنده و مقدار حجم آنها برای  PCRاز ompP2. 34

جدول 3-2- برنامه PCR برای تکثیر ژن ompP2. 34

جدول3-3- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای ompP2. 35

جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌های دریافتی از بیماران مورد مطالعه. 41

جدول 4-2 نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 42

جدول 4-3- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 3 در NCBI 47

جدول 4-4- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 5 در NCBI 48

جدول 4-5- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 8 در NCBI 49

جدول 4-6- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 35 در NCBI 50

جدول 4-7- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 47 در NCBI 51

جدول 4-8-. نتیجهBlast سکانس اسید نوکئیک شماره 14 در NCBI 52

فهرست اشکال

شکل1-1- ساختارشیمیایی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفا ت… 3

شکل1-3- کلو نی‌های هموفیلو س آنفولانزا روی محیط شکلات اگار. 5

شکل3-1-تست کاتالاز. 29

شکل 3-2- شکل باسیل گرم منفی هموفیلوس آنفلوانزا 30

شکل 3-3- دستگاه ترموسایکلر. 34

شکل 3-4- دستگاه الکتروفورز. 36

شکل4-1- ژن ompP2 ایزوله‌های با لینی… 43

شکل 4-2و4-3- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر Alu1برای ژنompP2 ایزوله‌های بالینی… 44

شکل 4-4- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر ECOR1برای ژن  ompP2ایزوله‌های بالینی… 44

شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2 نمونه شماره  14با پرایمر Forward.. 45

شکل 4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2نمونه شماره  14با پرایمر Revers. 45

شکل 4-7- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 46

شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 3.. 46

شکل 4-9- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 5  با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 47

شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 5.. 47

شکل 4-11- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 48

شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 8.. 48

شکل 4-13- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 49

شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 35.. 49

شکل 4-15- آنالیزو مقایسه نمونه شماره  47با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 50

شکل 4-16- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 47.. 50

شکل 4-17- آنالیزو مقایسه نمونه شماره 14 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 51

شکل 4-18- نواحی حفاظت شده پروتئین شماره 14.. 51

شکل 4-19- مقایسه ساختمانی اسیدآمینه پروتئینP2 ایزوله‌های بالینی با همدیگر. 54

فهرست نمودارها

نمودار 4-1- نتایجRFLP 52

نمودار 4-2- میزان درصد هر یک از الگو ها 53

نمودار 4-3- درصد جهش ها 53

چکیده:

هموفیلوس آنفلوانزا،یک باکتری گرم منفی و پاتوژن اختصاصی انسانی است که از نظر بیماری زایی می‏تواند ایجاد مننژیت حاد باکتریایی ،سپتی سمی،اپی گلوتیت،باکتریمی،عفونت گوش میانی کند. هدف این مطالعه بررسی یکی از این پروتئین ها ی حفاظت شده در باکتری هموفیلوس آنفلوانزا به منظور طراحی واکسن بومی علیه ان می‏باشد. پروتئینP2  ، بین 38 الی 40 كیلودالتون وزن داشته و بیش از 50 درصد كل پروتئینهای غشاء خارجی هموفیلوس را شامل می‏گردد و غالبا توسط سویه‏های فاقدكپسول و سویه b هموفیلوس ها بیان می‏شود.

این پروتئین به عنوان یک کاندیدای مناسب واکسن برای سویه‏های بدون کپسول هموفیلوس آنفلوانزا مطرح است. در این تحقیق ،اپیدمیولوژی ژن ompP2 با استفاده از نمونه‏های بالینی که از 30 بیمار جداسازی شده بودند،مورد بررسی قرار گرفت. باکتری ها در محیط شکلات اگار کشت داده شدند و تستهای بیوشیمیایی انها انجام شد. پس از تخلیص DNA،واکنش PCR انجام شد. همه نمونه ها از نظر وجود ژن ompP2) 1173(bp مثبت شدند. پس از تعیین توالی 6 نمونه و مقایسه توالی ژن ompP2 سویه‏های بومی با سویه‏های استاندارد و توالی موجود در بانک ژنی،با نرم افزار MEGA4 ،شباهت ها و تفاوت های ناشی از حذف ،اضافه و یا جابه جایی نوکلئوتیدی را نشان داد. جهت بررسی الگوی پلی مورفیسم ژن مورد نظر ،محصول PCR مورد هضم توسط آنزیم های Alu1 و EcoR1 قرار گرفتند. الگوی برش 21 نمونه (99%-98%) مشابه سویه‏های استاندارد باno:J3359. 1,M93268. 1,M93269. 1,M932701) (accessionبود و 9 نمونه (98%-91%) متفاوت بود. نتایج ما نشان دادکه ژن ompP2 از نظر سازماندهی ژنی،شبیه سویه‏های مختلف هموفیلوس آنفلوانزا ثبت شده در بانک ژنی است و در قسمت برش توسط آنزیم محدودالاثر Alu1دچار پلی مورفیسم شدند. لذا این پروتئین می‏تواند کاندید مناسبی برای واکسن باشد.