با بررسی گسترش خونی پرنده مبتلا، بعد از رنگ آمیزی آن به روش گیمسا یا رایت، این بیماری را می‌توان تشخیص داد. بعضی از سلولهای خونی حاوی گامت‌های لکوسیتوزئون می‌باشند. معمولأ شکل سلولهای مبتلا به وسیله گامت‌ها تغییر می‌کند واندازه آنها به طور مشخصی افزایش می‌یابد. درمقاطع بافت شناسی کبد و مغز، معمولأ شیزونت‌ها و مگالوشیزونت‌ها مشخص می‌باشند.
۲-۴- واکنش زنجیر‌های پلی مراز( PCR )
کاربرد:
تکنیک PCR کاربرد‌های نامحدودی در عرصه‌های مختلف زیست ملکولی دارد. علت اصلی این امر این است که DNA الگو به کار رفته در PCR را می‌توان از منابع مختلف تامین کرد و مورد استفاده قرار داد.
به طور کلی PCR به دو منظور اصلی به کار برده می‌شود :
۱-تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن
۲-بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA
برخی کاربرد‌ها یا این تکنیک شامل:
- تشخیص عوامل عفونی (ویروس‌ها، باکتری‌ها، انگل‌ها و… )
- تشخیص جهش‌ها (P.N.D و سرطان‌ها و… )
- کلون سازی ژن
- تعیین توالی‌های کروموزومی انسان در سلول‌های هیبریدی( هترو کاریون‌ها )
- تعیین جنسیت جنین
اساس کار
توسعه و انجام PCR یک تجربه در علم بیولوژیکی ملکولی ایجاد می‌کند. به کمک این تکنیک می‌توان ناحیه خاصی از ژن را که بین دو ناحیه شناخته شده DNA است تکثیر نموده تکثیر DNA با بهره گرفتن از پرایمر‌ها و ملکول‌های DNA الگو انجام می‌گیرد که تحت شرایط خاص پرایمر‌ها به DNA الگو متصل شده و با در دسترس بودن عوامل دیگرهمانندسازی DNA، ساخت قطعه‌ای از DNA آغاز می‌گردد. اگر شرایط مهیا باشد می‌توان از یک قطعه DNA در ۳۰ سیکل و در مدت کوتاهی تا ۵/۱ قطعه به دست آورد.
برای انجام PCR دو پرایمر مکمل DNA مورد احتیاج است این دو پرایمر در جهت مخالف با DNA هدف هیبرید می‌شوند DNA بین آن تکثیر می‌یابد. برای سنتز DNA، یک DNA پلی مراز مقاوم به حرارت مورد نیاز است. آنزیم (Taq) پلی مراز که از یک باکتری گرما دوست به نام ترموس اکواتیکوس بدست می‌آید. به عنوان مهم ترین آنزیم مورد استفاده برای PCR محسوب می‌گردد.

۲-۴-۱- مواد و وسایل لازم برای انجام برای انجام آزمایش PCR
- DNA هدف
- PCR Buffer 10X
- آنزیم DNA پلی مراز (Taq DNA Polymerase 5u/ul )
- نوکلئوتید‌ها یا دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP 10Mm)
- کلرورمنیزیم (MgCl2 50Mm )
- پرایمر
- بافر PCR و کمک کننده ها
- آب مقطر
- میکروتیوب ۵/۰ میلی لیتری
- میکروسانتریفیوژ
۲-۴-۲- سنتز
سنتز چند مرحله دارد :
۱-مرحله واسرشت سازی قطعات DNA
در این مرحله حرارت باعث تک رشته‌ای شدن ملکول‌های دو رشته‌ای DNA در حضور آغاز گرها، چهار نوع dNTP¸ بافرPCR و آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت می‌شود. درجه حرارت این مرحله معمولا بین ۹۵-۹۳ درجه سانتی گراد است.
۲-مرحله هم سرشت سازی:
با پایین آوردن درجه حرارت تا حد ۶۵-۳۷ درجه سانتی گراد بسته به TM مورد استفاده موجبات اتصال آغازگرها به DNA تک رشته شده فراهم می‌آید. پرایمرها ۳۰-۱۸ نوکلئوتید می‌باشند و اگر امکان داشته باشد پرایمرها را به گونه‌ای طراحی می‌کنند که TM پرایمر‌ها یکسان باشند.
برای بدست آوردن TMپرایمر هااز فرمول زیر استفاده می‌شود :
(تعداد بازهایC¸G) ×۴+(تعداد بازهایTM=2×(T¸A
درجه حرارت مناسب برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف ۵-۳ درجه سانتی گراد زیر TM می‌باشد چون آنزیم پلی مراز در درجه حرارت‌های مختلف فعال است از همان درجه حرارت لازم برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف به منظور طویل شدن DNA نیز استفاده می‌شود.
۳-بسط آغازگرها :
در این مرحله آنزیم DNA پلی مراز از ۳ انتهای پرایمر همانند سازی می‌کند. این آنزیم در ۷۲ درجه سانتی گراد بین ۴۵ تا ۱۰۰ نوکلئوتید در ثانیه همانند سازی می‌کند که این میزان بستگی به PH بافر غلظت نمک و DNA هدف دارد. سپس این فرایند حداقل برای ۲۰ سیکل دیگر تکرار می‌شود.
در فرایند PCR¸ درجه حرارت ۹۷-۹۴ درجه سانتی گراد برای جدا شدن دو زنجیره DNA و ۷۵-۵۵ درجه سانتی گراد برای همانند سازی لازم است ولی نهایتا سیکل آخر همانند سازی^[۲۲] ۵ دقیقه طول می‌کشد تا تمامDNA به رشته‌های دو زنجیره‌ای تبدیل شود.
۲-۴-۳- تشخیص و تجزیه فراورده‌های PCR:
فراورده‌های PCR عبارت از یک قطعه (یا قطعاتی) از DNA هستند که طول آنها معمولا برابر با ناحیه حد وسط در آغاز گر می‌باشد.
برای تشخیص و تعیین هویت قطعات تکثیر یافته از روش‌های مختلف می‌توان سود برد که این موارد عبارتند از :
الف) ژل الکتروفورز
ب) تشخیص آنی ناحیه تکثیری
ج) تشخیص ایمونولوژیکی فراورده‌های PCR
د) ارزیابی به وسیله جرقه با SPA^[23]
از مجموع موارد فوق تنها به توزیع مختصری در مورد روش ژل الکتروفورز که آسانترین و متداول ترین روش مورد استفاده است می‌پردازیم.
ژل الکتروفورز :
آسانترین، متداول ترین روش مورد استفاده برای تشخیص و تجزیه فراورده PCR الکتروفورز است. الکتروفورز مقداری از فراورده‌های PCR بر روی ژل آگارز یا ژل پلی اکریلامید، رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید( یک ماده رنگی که دارای خاصیت فلورسنت است) و آنگاه مشاهده ژل در زیر فرابنفش(uv) یکی از ساده ترین روش‌ها برای تشخیص و بررسی فراورده‌های PCR پس از رنگ آمیزی و با تابش نور uv به ژل مشاهده DNA و ژل، امکان پذیر می‌گردد. حال می‌توان از ژل عکس برداری کرد و نتیجه را ثبت کرد.
مارکر‌های مقیاسی و فراورده‌های PCR مربوط به کنترل آزمایش را می‌توان در چاهک‌های جانبی ژل قرار داد تا امکان تعیین دقیق اندازه قطعات تکثیر شده فراهم آید. مارکر‌های DNA در اندازه‌های مختلف به صورت تجاری قابل تهیه می‌باشند.
فصل سوم
«مواد و روش کار»