از نمونه گیاهی خشک شده ۳/۰ گرم را وزن کرده و در بالن ۵۰ میلی لیتری ریختیم. سپس ۳/۳ میلی لیتر از مخلوط هضم را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کردیم. نمونه هضم را به مدت یک شب در دمای اتاق قرار دادیم. نمونه هضم خالی را نیز آماده کردیم (Blank). سپس بالن را در دمای ۱۸۰ درجه بر روی گرمکن به مدت یک ساعت قرار دادیم. بعد از سرد شدن ۵ قطره هیدروژن پراکسید به آن اضافه کردیم. دوباره بالن را به مدت ۵ الی ۱۰ دقیقه در دمای ۲۸۰ درجه قرار دادیم تا بخار سفید مشاهده شود. دوباره ۵ قطره هیدروژن پراکسید به آن اضافه کرده و حرارت دادیم. این کار را آنقدر ادامه دادیم تا هضم بی رنگ شود. بعد اجازه دادیم در دمای اتاق سرد شود و با آب به حجم ۵۰ میلی لیتر رساندیم و از کاغذ صافی عبور دادیم.
بعد از پایان مرحله هضم برای قرائت میزان جذب نیتروژن با دستگاه اسپکتروفتومتر محلولهای زیر را به ترتیب تهیه کردیم.

• • محلول استوک آمونیوم سولفات

۱۷۹/۱ گرم NH4)₂SO2 ( را در آب حل کرده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رساندیم. (به خوبی پودر شد و قبل از توزین در دمای ۱۰۵ درجه خشک شد)

• • محلول سدیم هیدروکسید

۴۰ گرم NaOH را در ۱۰۰ میلی لیتر آب حل کردیم. (بعد از سرد شدن به حجم رساندیم)

• • محلول سالیسیلیک

۲۲ گرم C₇H₈O₃ را در ۲۱ میلی لیتر محلول سدیم هیدروکسید حل کرده و با آب به حجم ۵۰ میلی لیتر رساندیم. (قبل از مصرف تهیه شد)

• • محلول بافر pH 3/12

به ۳۲/۵ گرم Na₂HPO₄ ۵/۲ میلی لیتر محلول سدیم هیدروکسید اضافه کرده و به حجم ۵۰۰ میلی لیتر رساندیم.

• • محلول EDTA

۲ گرم Na₂EDTA.2H₂O را با آب به حجم ۵۰ میلی لیتر رساندیم.

• • محلول هیپوکلراید

۱۴ میلی لیتر وایتکس (۵ درصد کلر فعال) را با آب به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رساندیم. (روزانه تهیه شد)

• • محلول سدیم نیتروپروساید

۵۰ میلی گرم Na₂[Fe(CN)₅NO].2H₂O را با آب به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رساندیم. (قبل از مصرف تهیه شد)

• • واکنشگر۱

۵۰ میلی لیتر محلول سالیسیلیک را با ۱۰۰ میلی لیتر محلول نیتروپروساید و ۵ میلی لیتر محلول EDTA مخلوط کردیم.

• • واکنشگر۲

۲۰۰ میلی لیتر محلول بافر و ۵۰ میلی لیتر محلول هیپوکلراید را با هم مخلوط کردیم.
واسنجی:
برای ساخت محولهای استاندارد در یک بالن ۱۰۰ میلی لیتری، ۴۰ میلی لیتر آب و ۵/۴ میلی لیتر اسید سولفوریک ۹۶ درصد اضافه کرده و اجازه دادیم سرد شود. از محلول استوک آمونیوم سولفات صفر، ۱، ۲، ۳، ۴، ۵ و ۶ میلی لیتر به آن اضافه کرده و با آب به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رساندیم. این سری شامل صفر، ۲۵، ۵۰، ۷۵، ۱۰۰، ۱۲۵ و ۱۵۰ میلی گرم در لیتر نیتروژن بود.
شکل ۳-۱- خط برازش میزان جذب محولهای استاندارد
روش کار:
محلولهای استاندارد، Blank و نمونهی هضم شده را به نسبت ۱+۹ (v/v) با آب رقیق کردیم. ۲/۰ میلی لیتر از محلولهای استاندارد رقیق شده، Blank رقیق شده و نمونه هضم رقیق شده را در لوله آزمایش ریختیم. به هرکدام ۳ میلی لیتر از واکنشگر۱ و ۵ میلی لیتر از واکنشگر۲ را اضافه کرده و مخلوط کردیم. اجازه دادیم ۲ ساعت باقی بماند تا رنگ سبز آبی تشکیل شود. (این وضعیت تا ۱۰ ساعت پایدار است). ابتدا دستگاه را با نمونه Blank صفر کرده و سپس در طول موج ۶۶۰ نانومتر جذب را خواندیم و توسط خط رگرسیون محلول استاندارد غلظت نیتروژن بر حسب میلی گرم در لیتر بدست میآید (شکل۳-۱). برای محاسبه بر حسب میلی مول در کیلوگرم از فرمول زیر استفاده میکنیم:
معادله۴-۷
a : غلظت نیتروژن در نمونه هضم بر حسب میلی گرم در لیتر
V : حجم نهایی بعد از پایان فرایند هضم بر حسب میلیلیتر
W : وزن نمونه گیاهی بر حسب گرم
۳-۴-۱۱- کارایی نیتروژن: در مرحله اول کارایی نیتروژن با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد [۴۵]:
معادله ۴-۸