فصل اول:مقدمه

1-1 تعریف فلزات سنگین………………………………………………………………………………………… 3

1-2 منابع فلزات سنگین……………………………………………………………………………………………. 3

1-3 فلزات سنگین و خاک………………………………………………………………………………………… 4

1-3-1 فرم های فلزات درخاک………………………………………………………………………………….. 4

1-4 فلزات سنگین وگیاهان……………………………………………………………………………………….. 5

1-5 سمیت در فلزات سنگین درگیاهان………………………………………………………………………… 5

1-6 عوامل موثر برجذب فلزات سنگین………………………………………………………………………… 6

1-7 جذب فلزات سنگین از ریشه و انتقال به قسمت هی هوایی گیاه…………………………………… 7

1- 8 مکانیسم مقاومت به فلزات سنگین و سمیت زدایی…………………………………………………… 9

1-8-1 ترشحات ریشه……………………………………………………………………………………………… 10

1-8-2 غشا پلاسمایی………………………………………………………………………………………………. 11

1-8-3 فیتوکلاتین ها……………………………………………………………………………………………….. 11

1-8-4 متالوتیونئین ها………………………………………………………………………………………………. 12

1-8-5 اسید های آلی……………………………………………………………………………………………….. 12

1-8-6 آمینواسید ها…………………………………………………………………………………………………. 13

1-8-7 حجره بندی واکوئل ها……………………………………………………………………………………. 13

1-9 کادمیوم…………………………………………………………………………………………………………… 13

1-10 خواص شیمیایی و ویژگی کلی کادمیوم………………………………………………………………… 14

1-11 عوامل موثردر تحرک و قابلیت در دسترس بودن کادمیوم…………………………………………… 14

1- 12 سمیت کادمیوم دردر انسان……………………………………………………………………………….. 15

1-13 سمیت درحیوانات…………………………………………………………………………………………… 15

1- 14 عملکرد بیولوژیک و سمیت کادمیوم در گیاه………………………………………………………….. 15

1-15 مکانیسم جذب کادمیوم توسط گیاه………………………………………………………………………. 16

1-16 تاثیر عناصر دیگر در جذب کادمیوم……………………………………………………………………… 16

1- 17 حد مجاز کادمیوم در برخی محصولات کشاورزی………………………………………………….. 17

1-18 منابع کادمیوم………………………………………………………………………………………………….. 17

1-19 زیست پالایی…………………………………………………………………………………………………. 18

1-20 گیاه پالایی…………………………………………………………………………………………………….. 18

1-21 فرایند های خاص گیاه پالایی……………………………………………………………………………… 19

1-22 گیاهان بیش تجمع دهنده…………………………………………………………………………………… 19

1-23 اطلاعات کلی در مورد گیاه تاج ریزی………………………………………………………………….. 20

1-23-1 نام های رایج………………………………………………………………………………………………. 20

1-23-2 ریخت شناسی…………………………………………………………………………………………….. 20

1-23-3 زیستگاه…………………………………………………………………………………………………….. 21

1-23-1-1 پراکند گی تاج ریزی در ایران……………………………………………………………………… 21

1-24 خواص واثرات دارویی…………………………………………………………………………………….. 22

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1 عوامل موثر بر جذب فلزات سنگین……………………………………………………………………….. 24

2-2 تقسیم بندی گیاهان در برابر تنش فلزات سنگین……………………………………………………….. 25

2-2-1 خارج کنند گان فلز………………………………………………………………………………………… 25

2-2-2 معرف فلزی…………………………………………………………………………………………………. 25

2-2-3 گونه های گیاهی تجمع کننده فلزات…………………………………………………………………… 25

2-3 مقاومت به فلزات سنگین……………………………………………………………………………………. 26

2-3-1 خلاصه ای از مکانسیم های سلولی موثر در سمیت زدایی………………………………………… 27

2-4 پاسخ های گیاهان به فلزات سنگین……………………………………………………………………….. 27

2-4-1 اجتناب……………………………………………………………………………………………………….. 27

2-4-2 تحمل…………………………………………………………………………………………………………. 27

2-4-3 میزان تجمع………………………………………………………………………………………………….. 28

2-4-3-1 ممانعت كنندگان………………………………………………………………………………………… 28

2-4-3- 2 نشانگرها ……………………………………………………………………………………………….. 28

2-4-3-3 تجمع دهندگان………………………………………………………………………………………….. 28

2- 5 مزیت تجمع فلزات سنگین در بافت‌های گیاهان………………………………………………………. 28

\

2-5-1 جذب غیرانتخابی…………………………………………………………………………………………… 29

2-5-2 مقاومت به خشكی…………………………………………………………………………………………. 29

2-5-3 مقاومت به فلزات………………………………………………………………………………………….. 29

2-5-4 فرضیه دیسپوزال……………………………………………………………………………………………. 29

2- 5-5 تاثیر بر رشد سایر گیاهان……………………………………………………………………………….. 29

2- 5 – 6 دفاع در برابر پاتوژن‌ها و گیاه‌خواران………………………………………………………………. 29

2-6 ظرفیت تجمع فلز سنگین در بخش هوایی گیاه…………………………………………………………. 29

2-7 فلزات سنگین وگیاه بیش تجمع دهنده …………………………………………………………………… 30

2-8 كاربرد گیاهان بیش‌تجمع‌دهنده……………………………………………………………………………… 32

2-8-1 به كار بردن سیستم‌های متعددی كارائی فیتوریمیدیشن را افزایش می‌دهد…………………….. 33

2-9 مزایای استفاده ازگیاهان بیش تجمع دهنده……………………………………………………………….. 34

2-10 پاک سازی مناطق آلوده توسط گیاه بیش تجمع دهنده……………………………………………….. 34

2-10-1 فیتو اکستراکشن…………………………………………………………………………………………… 34

2-10-2 ریزوفیلتریشن…………………………………………………………………………………………….. 35

2-10-3 فیتواستبیلیشن……………………………………………………………………………………………… 36

2-10-4 فیتوولتالیزیشن…………………………………………………………………………………………….. 36

2-10-5 فیتودیگریدیشن…………………………………………………………………………………………… 36

2-11 کادمیوم وگیاه وخاک………………………………………………………………………………………… 37

2-12 اثرکادمیوم بررشدومورفولوژی گیاه……………………………………………………………………….. 37

2-13 کادمیوم وگیاه بیش انباشته ساز……………………………………………………………………………. 40

2-13-1 سنتز پروتئین های تنش…………………………………………………………………………………. 41

2-14 سیتوژنتیک…………………………………………………………………………………………………….. 41

2-14-1 تقسیم میتوز………………………………………………………………………………………………… 41

2-14-2 مطالعات کروموزومی……………………………………………………………………………………. 42

2-14-3 پیش تیمار………………………………………………………………………………………………….. 42

2-14-4 تثبیت……………………………………………………………………………………………………….. 42

2-14-5 هیدرولیز……………………………………………………………………………………………………. 43

2-14-6 رنگ امیزی ……………………………………………………………………………………………….. 43

2-14-7 له کردن…………………………………………………………………………………………………….. 43

2-15 کادمیوم وتقسیم سلولی……………………………………………………………………………………… 44

فصل سوم:مواد وروش ها

3-1 تهیه بستر مناسب برای ازمایش……………………………………………………………………………… 46

3-2 تهیه ترکیب کادمیوم…………………………………………………………………………………………… 46

3-4 تهیه بذرتاج ریزی……………………………………………………………………………………………… 46

3-5 ضدعفونی مواد گیاهی………………………………………………………………………………………… 46

3-6 ضدعفونی وسایل و سطح کار………………………………………………………………………………. 46

3-7 تهیه نمونه کروموزمی میتوز………………………………………………………………………………….. 47

3-7-1 مراحل آماده سازی نمونه میکروسکوپی……………………………………………………………….. 47

3-7-1-1 پیش تیمار………………………………………………………………………………………………… 47

3-7-1-2 تثبیت …………………………………………………………………………………………………….. 47

3-7-3-3 هیدرولیز………………………………………………………………………………………………….. 47

3-7-3-4 رنگ آمیزی………………………………………………………………………………………………. 48

3-7-3-5 تهیه اسلاید کروموزومی………………………………………………………………………………. 48

3-7-3-6 بررسی های میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 48

3-8 کاشت گلخانه ای………………………………………………………………………………………………. 48

3-9 برداشت گیاهان………………………………………………………………………………………………… 49

3-10 شاخص­های (صفات) مورفولوژیكی ……………………………………………………………………. 49

3-10-1 تعیین طول ریشه………………………………………………………………………………………….. 49

3-10-2 تعیین طول ساقه………………………………………………………………………………………….. 49

3-11 شاخص های(صفات) بیوشیمیای…………………………………………………………………………. 50

3-11-1 سنجش میزان رنگیزه های فتوسنتزی (کلروفیل و کاروتنوئیدها) ………………………………. 50

3-12-2 سنجش مقدار قندهای احیا کننده (روش سوموگی،نلسون)………………………………………. 50

3-12-2-1 تهیه عصاره گیاهی……………………………………………………………………………………. 51

3-12-2-2 تهیه محلولهای مورد نیاز…………………………………………………………………………….. 51

3-12-2-3 طریقه استفاده از این محلولها در سنجش مقدار قندها………………………………………… 51

3-12-2-4 رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………………………… 52

3-13 سنجش غلظت پروتئین به روش برادفورد…………………………………………………………….. 52

3-13-1 استخراج پروتئین…………………………………………………………………………………………. 52

3-13-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین (روش برادفورد) …………………………………………………. 52

3- 14 الکتروفورز یک بعدی پروتئینها…………………………………………………………………………………………………… 53

3- 14- 1 روش تهیه محلولها و بافرهای مورد نیاز در الکتروفورز…………………………………… 53

3-14- 1- 1 تهیه بافر استخراج تریس-ساکارز(pH=7.5) ………………………………………………………… 53

3-14- 1-2 محلول پایه آکریلامید-بیس آکریلامید(30 درصد آکریلامید +8/0 درصد بیس آکریلامید) ………………….. 53

3-14- 1-3 محلول پایه بافر ژل متراکم کننده (Tris-Hcl pH=6.8)…………………………………………………………….. 54

3- 14- 1- 4 محلول پایه بافر ژل تفکیک کننده (Tris-Hcl pH=8.8)………………………………………………………… 54

3-14- 1- 5 بافر الکترود یا بافر تانک (1000 میلی لیتر) ……………………………………. 54

3-14- 1- 6 محلول پایه بافر نمونه(2X) ……………………………………………………………………………… 54

3-14- 1- 7 محلول SDS………………………………………………………………………. 54

3-14- 1- 8 محلول آمونیوم پرسولفات…………………………………………………… 55

3- 14-2 روش تهیه ژلهای فوقانی و تحتانی……………………………………………………….. 55

3- 14- 2- 1 روش تهیه ژل تحتانی…………………………………………………………………. 55

3- 14-2-2 روش تهیه ژل فوقانی………………………………………………………………………… 55

3- 14 – 3 مراحل تهیه ژل الکتروفورز سیستم ناپیوسته به روش SDS-PAGE……………………………………………….. 56

3- 14- 3- 1 استخراج پروتئین از بافت برگ گیاه تاج ریزی………………………………………….. 57

3- 14- 3- 2 تثبیت پروتئینها………………………………………………………………………… 58

3- 14- 4 رنگ آمیزی ژل پلی اکریلامید……………………………………………………………… 58

3- 14- 4- 1 رنگ آمیزی با کوماسی بلو R 250…………………………………………….. 58

3- 14- 4-2 مواد مورد نیاز………………………………………………………………………… 58

3- 14- 4- 3 محلولهای مورد نیاز………………………………………………………………….. 58

3- 14- 5 تعیین وزن مولکولی با استفاده از الکتروفورز……………………………………………. 59

3- 14- 5- 1 روش کار……………………………………………………………………………… 59

3- 14- 5- 2 رسم منحنی استاندارد و تعیین وزن مولکولی پروتئینها…………………….. 59

3-15 تعیین میزان یون کادمیوم در اندام هوایی و ریشه به روش جذب اتمی……………….. 60

3-16 طرح آماری وآنالیز داده­ها ………………………………………. 60

 فصل چهارم:نتایج و بحث

4-2 نتایج حاصل از داده­های بخش فیزیولوژی گیاهی………………………………………………………. 62

4-2-1 طول اندام زمینی …………………………………………………………………………………………… 62

4-2-2 طول اندام هوایی……………………………………………………………………………………………. 63

4-2-3 كلروفیل a,b وکلروفیل کل…………………………………………………………………………….. 64

4-2-4 کاروتنوئید……………………………………………………………………………………………………. 66

4-2-5 قند ……………………………………………………………………………………………………………. 67

4-3 جذب کادمیوم دراندام های هوایی…………………………………………………………………………. 68

4-4 میزان پروتئین در برگ ها……………………………………………………………………………………. 69

4-5 بررسی کروموزومی……………………………………………………………………………………………. 70

4-6 بررسی ژل آکریل آمید پروتئین…………………………………………………………………………….. 71

4-6-1 ژل پروتئین………………………………………………………………………………………………….. 72

فصل پنجم: نتیجه گیری

5-1 جذب و انتقال كادمیوم درگیاه………………………………………………………………………………. 74

5-2 اثر كادمیوم بر رشد طولی ریشه و اندام هوایی…………………………………………………………… 76

5-3 اثر كادمیوم برمحتوای كلروفیل وكاروتنوئیدها ………………………………………………………….. 77

5-4 بررسی اثر كادمیوم بر محتوای قند در گیاه ………………………………………………………………. 78

5-5 بررسی اثر کادمیوم بر پروتئین های گیاه………………………………………………………………….. 79

5-6 بررسی اثر کادمیوم بر کروموزوم ها……………………………………………………………………….. 80

5-7 نتیجه کلی……………………………………………………………………………………………………….. 82

5-8 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………. 83

فصل ششم:منابع…………………………………………………………………………………………………….. 84

چکیده انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………… 95

چکیده

پاكسازی مواد آلاینده از خاك،آب و هوا از طریق گیاهان،گیاه­پالایی گفته می­شود.از این تكنولوژی و علم جدید امروزه جهت پاكسازی اكوسیستم­ها از موادآلاینده از جمله فلزات سنگین،شبه فلزات،مواد رادیواكتیو، علف­كش­ها و ئیدروكربن­های نفتی حلال­های كلره استفاده می شود.گیاهان مختلفی كه دارای توانایی جذب این آلاینده­ها هستند،اغلب از خانواده­هایAsteraceae ,Brassicaceae, Fabaceae Poaceaeو Amaranthaceae و گونه­هایی از خانواده Solnaceae

هستند.در این تحقیق با توجه به پدیده گیاه­پالایی و توانایی تاجریزی که گونه­ای از خانواده سولاناسه است در این زمینه،سعی شد تا علاوه برمطالعه برخی اثرات منفی کادمیوم به عنوان فلز سنگین غیر ضروری برای رشد گیاه، برکروموزوم­های متافازی میتوزو میزان پروتئین کل گیاه نیز تحقیق شود.از این رو هدف این تحقیق بررسی اثر کادمیوم بر رفتار کروموزوم در تقسیم میتوز و الگوی الکتروفورتیک پروتئین­ها در گیاه تاجریزی است.

آزمایش در قالب طرح کامل تصادفی با 6 سطح تیمار کادمیوم]صفر(شاهد)،1000،500،250،125،62.5 میلی مولار[ با چهار تکرار در گلخانه تحقیقاتی وآزمایشگاه­های ماهان کرمان انجام شد.مطالعه کروموزوم ­­های متافاز میتوزی از آنجا که بطور طبیعی اندازه کروموزوم­های این گونه کوچک است بررسی­ها نشان داد که کادمیوم اثری بر تعداد کروموزوم­ها نداشته و 2x=2n=24 می باشد واز طرفی مطالعه ژل پروتئین نیز مشخص کرد که کادمیوم نتوانسته برمیزان پروتئین­ها اثرمنفی بگذارد و مشخص شد که در غلظت­های 500و1000 میلی مولار نسبت به شاهد افزایش بیان پروتئین دیده شده است که این افزایش سطح پروتئین نقش حفاظتی برای سلول در حال تنش کادمیوم دارد.دراثبات توانایی جذب این گیاه بررسی جذب اتمی نیز مشخص کرد که میزان جذب کادمیوم در تاجریزی با افزایش غلظت تیمار­ها بصورت قابل توجهی افزایش داشته است.تنش کادمیوم به طور چشمگیری از میزان قندها گیاه کاسته است که این کاهش با توجه به بیش تجمع­دهنده بودن تاجریزی یک مکانیسم سازشی برای حفظ متابولیسم پایه سلول در برابر تنش کادمیوم بوده است.نتایج بررسی­های مورفولوژیکی نشان داد که کادمیوم بر طول ریشه و اندام هوایی این گیاه بی اثر بوده است(به دلیل عدم تاثیر بر کروموزوم های میتوزی در سلول هاس مریستمی انتها ی ریشه).اندازه­گیری سطوح کلروفیل a,b، کلروفیل کل،کاروتنوئید نشان داد که تیمارها اثر معنی داری بر روی رنگریزه­ها نداشته اند،که این یافته­ها همگی حاکی از این است که تاج­ریزی با دارا بودن توانایی جذب و تجمع فلز سنگین کادمیوم در خود می تواند گیاه مناسبی برای مطالعات گیاه­پالایی محسوب گردد.از جمله اهداف عملی و کاربردی این تحقیق می توان به بررسی میزان ظرفیت جذب کادمیوم توسط گیاه تاجریزی،تغییر احتمالی رفتار کروموزوم­ها در تقسیم میتوز تحت استرس،مطالعه و بررسی تغییرات احتمالی الگوی الکتروفورتیک پروتئین­های تحت تنش بیان شده درتاجریزی،بررسی توانایی رفع آلودگی­های عناصر سنگین از آب و خاک­های آلوده و احتمالا هوای آلوده، به علت جذب و تجمع آسان کادمیوم و پتانسیل بالای کادمیوم در آلودگی محیط زیست اشاره کرد.

کلمات کلیدی:تاج­ریزی،گیاه­پالایی،کادمیوم،تقسیم میتوز،میزان­پروتئین

 1-1 تعریف فلزات سنگین

فلزات سنگین[1] به عناصر فلزی با وزن مخصوص بالاتر از 5 گرم بر سانتی‌متر مکعب گفته می‌شود. این فلزات در طبیعت به صورت کاتیون‌ها و آنیون‌های اکسید شده وجود دارند. عناصری نظیر نیکل، کروم، کبالت، جیوه، روی، کادمیوم، مس و منگنز به صورت کاتیون در خاک می‌باشند، در حالی که عناصری نظیر مولیبدن، سلنیوم،آرسنیک و بور به صورت ترکیب با اکسیژن در خاک بوده و دارای بار منفی می‌باشند (شاو،1995؛گاد2،1993).هم‌چنین فلزات سنگین به عنوان عناصری با خصوصیات فلزی (انعطاف‌ پذیری، رسانائی، پایداری مانند كاتیون‌ها، لیگاند اختصاصی و غیره) و عدد اتمی بزرگ‌تر از 20 تعریف می‌شوند (پندیاس3،1992)به طور كلی یون‌های فلزات سنگین را بر اساس اسیدیته‌ی لوئیس4 و تمایل آن‌ها به لیگاندهای مختلف در دو گروه مجزا قرار می‌دهند. گروه اول شامل یون‌های فلزی نرم از قبیل جیوه، کادمیوم، نقره، مس و پلاتینیوم است كه ترجیحاً از طریق پیوندهای كوالانسی با لیگاندهای قطبی پیوند می‌شوند. گروه دوم شامل یون‌های فلزی اهن، روی، نیکل،کبالت ، سرب می‌باشد كه بیشتر تمایل دارند با لیگاندهای واسطه از قبیل آمین‌ها، آمید‌ها و ایمین‌ها پیوند شوند (نایبروهمکاران5، 1980). همه یون‌های فلزی صرف نظر از این‌كه در كدام گروه قرار می‌گیرند در غلظت‌های بالاتر از حد بحرانی خود در خاك برای گیاهان سمی می‌باشند.

امروزه در اکثر کشور های صنعتی برای غلظت عناصر سنگین حد مجاز تعیین شده است. ولی به علت این که غلظت مجاز این عناصر در کشور های مختلف یکسان نبوده و دامنه تغییرات بین حداقل و حداکثر غلظت گاهی به 100 برابر هم می رسد، این مساله قابل تعمیم نیست. عناصر سنگین در رفتار بیوشیمیایی خود معمولاً از عناصر ضروری تقلید می کنند. مثلاً نیکل از کبالت، کادمیوم از روی، سرب از کلسیم و سلنیم از گوگرد تقلید می کنند.

1-2 منابع فلزات سنگین

این عناصر از دو راه کلی زیر به خاک وارد می شوند:

الف)هوادیدگی سنگ های معدنی

ب)فعالیت های انسانی

منایع آلاینده ناشی از فعالیت های انسان شامل موارد زیر است:

الف) ذوب و استخراج فلزات

ب) فعالیت های صنعتی

ج) رسوبات اتمسفری

د) فاضلاب ها

ه) فعالیت های کشاورزی مثل استفاده از آفت کش های حاوی فلزات سنگین، کود و مواد بهساز خاک و حشره کش ها

1-3 فلزات سنگین در خاك

فلزات سنگین در خاك تركیباتی طبیعی یا نتیجه‌ای از فعالیت انسان می‌باشند. مناطق معدنی غنی از فلزات، گداختن فلزات، آب فلز دادن، گاز حاصل از اگزوز، استفاده از سوخت‌های فسیلی، به كار بردن كودها و حشره‌كش ها و تولید فاضلاب شهری از مهم‌ترین فعالیت‌های انسان است كه خاك را با مقادیر زیادی از فلزات سمی آلوده می‌كند (براد [2]و همکاران، 1978 ؛ریچاردسون2، 1990).

مقادیر بیش از حد طبیعی فلزات در خاک به دلیل جذب توسط گیاهان و ورود به زنجیره‌های غذائی به عنوان منابع آلاینده محیط محسوب می‌شوند و می‌توانند باعث نابودی گیاهان شوند (شاو3، 1989).

1-3-1 فرم های فلزات در خاک (تسیر4 وهمکاران ، 1979)

الف) یون‌های فلزی آزاد و کمپلکس‌های فلزی محلول در محلول خاک.

ب) پیوند شده با بارهای منفی ترکیبات غیرآلی خاک در محل‌های تبادل یونی.

پ) باند شده به موادآلی خاک.

ت) رسوب با اکسیدها، هیدروکسیدها و کربنات‌ها.

ث) حضور در ساختمان کانی‌های سیلیکاتی.

فلزات فقط در حالت‌های الف و ب سریعاً توسط ریشه گیاهان جذب می‌شوند(لاسات5 2000).

1-4 فلزات سنگین وگیاهان