کازئینها فسفوپروتئینهایی هستند که 80 درصد پروتئینهای شیرگاو را تشکیل میدهند. این پروتئینها شامل انواع مختلف نظیرαS1 ، αS2، β و κ میباشند. اگرچه آلرژیزایی این پروتئینها امروزه یکی از چالش های بزرگ علم پزشکی است، اما آنها به عنوان منبع غنی پپتیدهای فعال زیستی با فعالیتهای مختلف از جمله خاصیت آنتیاکسیدانی و فعالیت ضد فشار خون میباشند. در این پژوهش کازئینبتا با استفاده از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی دی اتیل دی آمینواتیل-سلولز خالص شد. سپس کل کازئینهای شیرگاو و کازئین بتا به روش غیرآنزیمی و در شرایط احیایی قندی شد. نتایج آزمون جذبی اُ-فتالدئید و نشری فلورسامین حاکی از درصد بالای قندی شدن این پروتئینها در روش احیایی بود. مطالعهی ساختاری کازئینبتا با استفاده از دستگاه فلورسانس و دستگاه دورنگنمایی دورانی بیانگر تغییرات قابل توجه ساختار این پروتئین ضمن فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی بود. از منظر فعالیت چاپرونی دو کازئینبتای قندی و غیرقندی تفاوت قابل ملاحظهای را نشان دادند. در این مطالعه پس از هضم ناقص این پروتئینها با دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین، خواص آنتی اکسیدانی، توانایی مهار آنزیم ACE و فعالیت آلرژیزایی آنها و پپتیدهای حاصل از هضمشان بررسی شد. نتایج این پژوهش پیشنهاد میکند که در تمام موارد هم با قندی شدن هم طی هضم ناقص کازئینها فعالیت آنتیاکسیدانی این پروتئینها تا حدودی بهبود مییابد. نتایج این پژوهش پیشنهاد میکند که خاصیت آلرژیزایی کازئینبتا بعد از قندی شدن و هضم آنزیمی با آنزیمهای فوقالذکر به طور معنا داری تغییر نمی کند. همچنین نتایج این پژوهش نشان داد که فعالیت آلرژیزایی تنها کازئینهای شیرگاو که با قند لاکتوز قندی شده بودند ضمن هضم ناقص با آنزیم کیموتریپسین کاهش مییابد. همچنین مطالعهی فعالیت مهاری آنزیم ACE پیشنهاد میکند که کازئینبتای غیرقندی و محصولات پپتیدی حاصل از هضم آنزیمی ناقص آن نسبت به پروتئینهای قندی و محصولات هضم ناقص آنزیمی آنها خاصیت مهار آنزیم ACE بیشتری را دارد. در مجموع به منظور دستیابی محصولات هضمی کازئینی با توان آلرژیزایی کمتر و خواص زیستی ارتقا یافته به مطالعات بیشتری همراه با تغییر شرایط آزمایشگاهی نظیر تغییر زمان هضم و یا تغییر نسبت پروتئاز به سوبسترای کازئینی ضروری به نظر میآید.
واژگان کلیدی:
ساختار کازئینبتا، فعالیت چاپرونی، فعالیت مهار آنزیم ACE، فعالیت آنتیاکسیدانی، آلرژیزای.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1- شیر………………………………………………………………………………………………… 2
1-2- ترکیبات شیر………………………………………………………………………………………………………………… 4
1-3- پروتئینهای شیر…………………………………………………………………………………………………………. 5
1-3-1- پروتئینهای آب پنیر………………………………………………………………………………………… 6
1-3-2- کازئینها…………………………………………………………………………………………………………….. 7
1-3-3- کازئینبتا…………………………………………………………………………………………………………….. 9
1-4- فعالیتهای زیستی کازئینها…………………………………………………………………………………….. 11
1-4-1- فعالیت چاپرون کازئینهای شیر…………………………………………………………………….. 11
1-4-2- پپتیدهای فعال زیستی……………………………………………………………………………………. 12
1-4-2-1- پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………………………………. 12
1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………….. 12
1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………….. 12
1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون……………………………………………………………… 12
1-4-2-3-2- فعالیت آنتیاکسیدانی………………………………………………………………… 14
1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد…………………………………………………………………….. 15
1-5-1- عدم تحمل لاکتوز……………………………………………………………………………………………. 15
1-5-2- آلرژی به پروتئینهای شیر……………………………………………………………………………… 16
عنوان صفحه
1-5-2-1- معرفی انواع آزمونهای رایج جهت مطالعهی فرآیند آلرژی……………… 18
1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19
1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها……………………………………………………………………………. 20
فصل دوم: مروری بر پژوهشهای پیشین………………………………………. 23
فصل سوم: مواد و روشهای تحقیق
3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27
3-2- تهیهی محلولها……………………………………………………………………………. 28
3-2-1- تهیهی محلولهای کازئینی، کازئینبتا و تعیین غلظت آنها………………………. 28
3-2-2- تهیهی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با
استفاده از کازئینبتا……………………………………………………………………………. 28
3-2-3- تهیهی محلولهای مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30
3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30
3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30
3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31
3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31
3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31
3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلیلیتر……………………………………………… 31
3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32
3-2-3-8- تهیه 100 میلیلیتر محلول کوماسیبلو……………………………………………… 33
3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33
3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلیلیتر……………………………………………………. 33
3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34
عنوان صفحه
3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35
3-2-7- تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36
3-2-8- تهیه عصارهی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37
3-3-روشها………………………………………………………………………………………… 38
3-3-1- تخلیص کازئینبتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38
3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39
3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE…………………………… 40
3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40
3-3-5- قندی کردن کازئینبتا و کازئینهای شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41
3-3-6- آزمونهای OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند
قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41
3-3-7- مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی……………………. 42
3-3-8- مطالعهی فلورسانس عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی……………….. 43
3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئینهای بتای قندی و غیرقندی،
با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43
3-3-10- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی………………… 44
3-3-11- هضم کازئینهای شیرگاو و کازئینبتای قندی و غیرقندی
به وسیلهی آنزیمهای تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44
3-3-12- مطالعهی فعالیت آنتیاکسیدانی کازئینهای شیرگاو کازئینبتای
قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45
3-3-13- مطالعهی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینبتا
قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها……………………………………… 47
3-3-14- مطالعهی توان آلرژیزایی کازئینها و کازئینبتای قندی
و غیرقندی……. 47
عنوان صفحه
3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیتهای زیستی
(چاپرونی، آنتیاکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژیزایی کازئینبتا………………………………. 50
4-1-1- تخلیص پروتئین کازئینبتا………………………………………………………………………………. 50
4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51
4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا
در حضور مادهی احیا کننده………………………………………………… 52
4-1-3-1- مطالعهی قندی شدن کازئینبتا با استفاده از ترکیب OPA……………… 53
4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا با استفاده
از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54
4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند
قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا……………………………………………………………………………… 55
4-1-4- مطالعهی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی…… 56
4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با استفاده
از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58
4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی………………………. 60
4-1-7- هضم آنزیمی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با آنزیمهای
تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62
4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE
(15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63
عنوان صفحه
4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای بتای قندی
و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنها………………………………………………………… 65
4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای
بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها………………………… 71
4-1-8- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای
حاصل از هضم آنزیمی آنها…………………………………………………………………………………………… 73
4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتیاکسیدانی
و آلرژیزایی کازئینهای شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77
4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77
4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئینهای شیرگاو……………………………………………….. 77
4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید
قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77
4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی
کازئینهای شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78
4-2-3- هضم آنزیمی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیمهای
تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80
4-2-4- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو
و پپتیدهای حاصل از هضم آنها………………………………………………………………………………….. 82
4-2-5- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای
حاصل از هضم آنزیمی آنها به وسیلهی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86
عنوان صفحه
خلاصهی نتایج ………………………………………………………………………………. 90
