برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

فصل اول. 1

مقدمه و کلیات.. 1

1-1 مقدمه. 2

1-1-1 گاو 4

1-1-2 گاومیش رودخانه ای.. 4

1-1-3 گوسفند. 5

1-1-4 بز. 6

1-1-5 اهداف.. 7

1-2 كلیات.. 7

1-2-1 تاریخچه مطالعات سیتوژنتیك در دامپروری.. 7

1-2-2 منطق نقشه یابی ژن ها روی كروموزوم. 8

1-2-3 نقشه های لینكاژی.. 9

1-2-4 نقشه های فیزیكی.. 9

1-2-5 نقشه یابی مقایسه ای و اصلاح دام. 10

1-2-6 همولوژی.. 11

1-2-7 کشت سلول های خونی.. 11

1-2-7-1 تاریخچه. 11

1-2-7-2 اصول بنیادی.. 12

1-2-8 تکنیک های باندینگ (رنگ آمیزی) كروموزوم ها 12

1-2-8-1 تاریخچه. 12

1-2-8-2 اصول پایه ای.. 13

1-2-9- هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 15

1-2-9-1 تاریخچه. 15

1-2-9-2 اصول بنیادی.. 15

1-2-9-3 استفاده از FISH در پژوهش های ستوژنتیک حیوانات اهلی.. 16

1-2-9-4 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH برای تایید صحت گردآوری های ژنوم موجودات.. 17

1-2-9-5 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH برای اتصال نقشه های لینكاژی و RH روی كروموزوم ها 19

1-2-9-6 استفاده از مكان یابی فیزیكی ژن ها با تكنیك FISH در رهیافت كلونینگ موقعیتی ژن ها و QTLها 20

1-2-10 انواع پروب های کلون DNA ژنومی استفاده شده در FISH.. 21

1-2-11 ایمونوفلوروسنس… 21

1-2-12 ویژگی های متافاز ها و نقشه های سیتوژنتیك خانواده گاو سانان. 22

1-2-12-1 آتوزوم ها و نقشه های سیتوژنتیك… 22

1-2-12-2 كروموزوم های جنسی.. 26

1-2-13 بررسی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 27

1-2-13-1 ژن برولا (FecB) 27

1-2-13-2 ژن GDF9 (FecGH) 28

1-2-13-3 ژن BMP15 (FecX) 29

1-2-13-4 اثر متقابل بین جهش های موثر بر باروری.. 30

فصل دوم. 32

بررسی منابع. 32

2-1 سابقه مطالعات سیتوژنتیک و نقشه یابی ژن ها با تكنیك FISH در حیوانات مزرعه ای.. 33

2-2 سابقه مطالعه ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حیوانات مزرعه ای.. 37

فصل سوم. 40

مواد و روش ها 40

3- مواد و روش ها 41

3 – 1  تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی.. 41

3 – 1- 1 تهیه ی نمونه های خون. 41

3 – 1- 2 کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های  مناسب برای FISH.. 41

3-2 انتخاب و سفارش كلون های BAC.. 42

3-2-1 شناسایی كلون های BAC حاوی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9. 44

3-2-1-1 ژن BMPR1B.. 45

3-2-1-2 ژن BMP15. 46

3-2-1-3 ژن GDF9. 47

3-3 كشت باكتری های حاوی كلون های BAC و استخراج DNA.. 48

3-4 نشاندارسازی DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 51

3-5 تهیه كاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز. 51

3-6 هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH) 51

3-7 مراحل بعد از FISH.. 52

3-7-1 آشكار سازی سیگنال های FITC.. 53

3-7-2 RBPI- باندینگ… 53

3-8 بررسی میكروسكوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC.. 53

3-9 تعیین محل دقیق (باند كروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی كروموزوم ها 54

فصل چهارم. 55

نتایج.. 55

4- نتایج.. 56

4-1 كیفیت DNA استخراج شده از كلون های BAC.. 56

4-2 نتایج حاصل از كشت سلولی و كاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ    56

4-2-1 كاریوتایپ RBA- باندینگ گاو (BTA) 56

4-2-2 كاریوتایپ RBA- باندینگ گاو میش رودخانه ای (BBU) 56

4-2-3 كاریوتایپ RBA- باندینگ گوسفند (OAR) 56

4-2-4 كاریوتایپ RBA- باندینگ بز (CHI) 57

4-3 جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تكنیك FISH روی كروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه. 57

4-3-1 جایگاه فیزیكی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو (BTA) 57

4-3-2 جایگاه فیزیكی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو میش رودخانه ای (BBU) 57

4-3-3 جایگاه فیزیكی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گوسفند (OAR) 57

4-3-4 جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در بز (CHI) 58

4-4 مقایسه جایگاه فیزیكی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با انسان. 58

فصل پنجم. 96

بحث و نتیجه گیری.. 96

5- بحث.. 97

5-1 نقشه های ژنتیکی.. 97

5-2 تفاوت های نقشه های فیزیكی و لینكاژی.. 98

5-3 ژنومیکس مقایسه ای.. 99

5-4 نتیجه گیری نهایی.. 103

5-5 پیشنهادات.. 103

واژه نامه. 104

منابع و مآخذ. 106

Abstract 121

 

فهرست جداول

جدول 3-1. مواد استفاده شده در كشت سلول های لنفوسیت خون در پژوهش حاضر. 43

جدول 3-2. مشخصات كتابخانه BAC ژنوم گاوی موسسه INRA فرانسه. 44

جدول 3-3. مشخصات كامل كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر.44

جدول 3-4. تركیبات محلول های P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA.. 50

جدول 4-1. جایگاه های ژنی نقشه یابی شده، کلون های BAC شناسایی شده

فهرست شکل ها

شکل 2-1.  مقایسه ایمونوفلوروسنس مستقیم و غیر مستقیم. 22

شکل 3-1. اطلاعات كلون  BtINRA-152G11استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B.. 45

شکل 3-2. اطلاعات كلون  BtINRA-745D07 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMPR1B. 46

شکل 3-3. اطلاعات كلون  BtINRA-320H10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 47

شکل 3-4. اطلاعات كلون  BtINRA-748C10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن BMP15. 48

شکل 3-5. اطلاعات كلون  BtINRA-544F11 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 49

شکل 3-6. اطلاعات كلون  BtINRA-444D9 استفاده شده به عنوان پروب در مكان یابی ژن GDF9. 50

شکل 3-7. مراحل نشاندار سازی DNA با روش Nick Translation. 52

شکل 4-1. نتایج حاصل از استخراج DNA از كلون های BAC استفاده شده در پژوهش حاضر. 60

شکل 4-2. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاو (BTA) در پژوهش حاضر. 61

شکل 4-3. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو 62

شکل 4-4. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گاومیش رودخانه ای (BBU) در پژوهش حاضر. 63

شکل 4-5. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گاو میش رودخانه ای.. 64

شکل 4-6. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای گوسفند (OAR) در پژوهش حاضر. 65

شکل 4-7. آیدیوگرام های G- باندینگ (چپ) و R- باندینگ (راست) گوسفند. 66

شکل 4-8. كاریوتایپ RBA- باندینگ تهیه شده برای بز (CHI) در پژوهش حاضر. 67

شکل 4-9. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 68

شکل 4-10. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گاو (BTA) 69

شکل 4-11. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 70

شکل 4-12. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو (BTA) 71

شکل 4-13. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA). 72

شکل 4-14. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 گاو (BTA) 73

شکل 4-15. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش رودخانه ای (BBU). 74

شکل 4-16. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 7 گاو میش رودخانه ای (BBU) 75

شکل 4-17. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 76

شکل 4-18. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گاو میش رودخانه ای (BBU) 77

شکل 4-19. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاومیش (BBU). 78

شکل 4-20. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 9 گاو میش رودخانه ای (BBU) 79

شکل 4-21. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 80

شکل 4-22. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 گوسفند (OAR) 81

شکل 4-23. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 82

شکل 4-24. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم X گوسفند (OAR) 83

شکل 4-25. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گوسفند (OAR). 84

شکل 4-26. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 5 گوسفند (OAR) 85

شکل 4-27. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMPR1B با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 86

شکل 4-28. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMPR1B روی كروموزوم شماره 6 بز (CHI) 87

شکل 4-29. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن BMP15 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 88

شکل 4-30. موقعیت دقیق کروموزومی ژن BMP15 روی كروموزوم شماره X بز (CHI) 89

شکل 4-31. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در بز (CHI). 90

شکل 4-32. موقعیت دقیق کروموزومی ژن GDF9 روی كروموزوم شماره 7 بز (CHI) 91

شکل 4-33. جزئیات سیگنال های مربوط به نقشه یابی فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تکنیک FISH و کلون BAC روی کروموزوم های RBPI-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI). 92

شکل 4-34. جایگاه  فیزیکی ژن BMPR1B روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 93

شکل 4-35. جایگاه  فیزیکی ژن BMP15 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 94

شکل 4-36. جایگاه  فیزیکی ژن GDF9 روی کروموزوم های R-باندینگ در گاو (BTA)، گاومیش رودخانه ای (BBU)، گوسفند (OAR) و بز (CHI) و مقایسه آن با انسان (HSA). 95

 

چکیده

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. هدف مطالعه حاضر مكان یابی فیزیكی مقایسه ای كلون های BAC گاوی حاوی ژن های باروری فاکتور رشد تمایز یافته 9 (GDF9)، پروتئین ریخت زای استخوان 15 (BMP15) و گیرنده نوع یك آن (BMPR1B) با استفاده از تكنیك هیبرید سازی در محل فلورسنتی (FISH) برای اولین بار روی كروموزوم های R- باندینگ گاو (BTA, 2n=60)، گاو میش رودخانه ای (BBU, 2n=50)، گوسفند (OAR, 2n=54) و بز (CHI, 2n=60) با توجه به استاندارد ISCNDB 2000 بوده است. برای تهیه كروموزوم های R- باند شده با وضوح زیاد، نمونه های خون كامل از گونه های مورد مطالعه با وارد سازی دیر هنگام BrdU و Hoechst33258 كشت شدند. كلون های BAC حاوی ژن های مورد نظر از روی آخرین سازه ژنوم گاوی با توجه به گردآوری های توالی ژنوم گاوی UMD_3.1 و Btau_4.6.1 شناسایی شده و سپس از كتابخانه BAC گاوی موسسه INRA تهیه شدند. پس از کشت کلون ها، استخراج DNA و نشاندار سازی آن با روش Nick translation، اسلایدهای متافازی در حضور COT-l DNA گاوی به مدت یک شب تحت تیمار FISH قرار گرفتند. مراحل ردیابی سیگنال های FITC و تهیه متافازهای RBPI- باندینگ به ترتیب با استفاده از سیستم آنتی بادی های FITC-avidin و anti-avidin و رنگ آمیزی اسلایدها با پروپیدیوم آیوداید انجام شد. تجزیه و تحلیل FISH موقعیت دقیق فیزیكی و باندهای كروموزومی مربوط به ژن های مورد مطالعه را روی متافازهای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز نشان داد. جایگاه دقیق فیزیكی ژن BMPR1B در گاو، گوسفند و بز یكسان بود (BTA/OAR/CHI6q15). در گاومیش رودخانه ای، ژن BMPR1B روی موقعیت BBU7q21 مكان یابی شد. ژن BMP15 در گاو و گاومیش رودخانه به ترتیب روی BTAXq31 و BBUXq36 و در موقعیت همولوگ (OAR/CHIXq24) در گوسفند و بز مكان یابی شد. برای جایگاه GDF9، موقعیت های كروموزومی BTA7q22.3، BBU9q24، OAR5q22.3  و CHI7q22.3 به ترتیب برای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز شناسایی شدند. داده های حاصل شده از مطالعه حاضر علاوه بر توسعه نقشه های سیتوژنتیك گونه های مطالعه شده باعث توسعه اتصال نقشه های ژنتیكی روی باندهای اختصاصی كروموزومی شده و همچنین می تواند برای مطالعات ساختاری و عملكردی دقیق تر ژن های اخیر مخصوصاً در گاوسانان مورد استفاده قرار گیرد. انتظار می رود كه علاوه بر ردیابی دقیق موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، بتوان هر چه بیشتر از تکنیک های مبتنی بر سیتوژنتیک مولکولی در مطالعات مرتبط به شناسایی نواقص کروموزومی و امکان ارتباط آن ها با صفات اقتصادی، خصوصاً صفات تولید مثلی در دام های اهلی استفاده نمود. قابل ذکر است که شناسایی موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، منجر به این خواهد شد که ردیابی QTLها در حوالی این ژن ها هر چه سریع تر و با هزینه کمتر گیرد.

كلمات كلیدی: BMPR1B، BMP15، GDF9، نقشه یابی با FISH، كلون های BAC، گاو، گاومیش رودخانه، گوسفند، بز.

فصل اول
مقدمه و کلیات
1-1 مقدمه
هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. اگر چه نقشه های ژنتیکی که تا کنون برای حیوانات اهلی تهیه شده­اند برای ردیابی ژن ها و جایگاه های صفات کمی در فواصل 10-5 سانتی مورگان (cM) و شروع برنامه های MAS کفایت می کنند، اما شناسایی دقیق جایگاه فیزیکی ژن ها و سپس كلونینگ و ردیابی واریانس های ژنتیکی آن ها و در گام بعدی مطالعه ارتباط این واریانس ها با صفات اقتصادی در اکثر موارد به ویژه در نژادهای موجود در کشورهای در حال توسعه از جمله ایران، به پژوهش های بیشتری نیاز دارند. به کارگیری داده های ژنوتیپی در ارزیابی های ژنتیکی تجاری و استراتژی های انتخاب بهینه، از جمله چالش های اصلاح نژادی می باشند که قطعاً نیازمند پیشرفت های بیشتری هستند.

كاربرد سیتوژنتیك در دام های اهلی از تكنولوژهای مفید برای توسعه ژنتیكی دام های اهلی است. سیتوژنتیك می تواند برای انتخاب حیوانات مولد فاقد نواقص كروموزومی مسئول نواقص فیزیكی (آنیوپلوئیدی)، باروری كمتر (نواقص بالانس كروموزومی) یا ناباروری (نواقص كروموزوم های جنسی) استفاده شود. همچنین سیتوژنتیك می تواند برای بررسی آلودگی های محیطی با مطالعه حیوانات موجود در مناطق آلوده و استفاده از آن ها به عنوان شناساگرهای بیولوژیكی استفاده شود (یانوزی، 2007).

مك كوسیك (1980) پیشنهاد داد كه ژنوم را به عنوان بخشی از آناتومی باید مورد توجه قرار داد. آناتومی ژنوم هم از نگاه ساختاری و هم از نگاه عملكردی برای موجودات بسیار مهم است. آنالیز ژنوم گونه های اهلی ما را قادر به شناسایی و فهم مكانیسم كنترل ژنتیكی صفات مهم اقتصادی می كند. نقشه یابی ژن ها قدم اول در آنالیز ژنوم موجودات است. با در دسترس قرار گرفتن نقشه های دقیق كروموزومی و توالی های DNA، یك پژوهشگر می تواند در اكثر موارد با جستجو در بانك داده های نقشه یابی، روی یك ناحیه كاندید در ژن مورد نظر خود تمركز كند تا اینكه ساعت ها تا ماه ها زمان را صرف فعالیت های آزمایشگاهی وقت گیر كند. با توجه به اشتباهات موجود در نقشه های لینكاژی و همچنین گردآوری های توالی ژنومی حیوانات، بهترین روش برای كاهش اشتباهات نقشه یابی ژن­ها استفاده همزمان از اطلاعات نقشه ها و توالی یابی برای تایید ترتیب ژنی در جایگاه های مورد نظر است (ویلسون و همکاران، 2001).