فهرست مطالب:

چکیده …………………………………………………………………………………………… 1

مقدمه …………………………………………………………………………………………..3

فصل اول کلیات ……………………………………………………………………………….. 5

1-1-پیشینه تاریخی ………………………………………………………………………….. 6

1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ………………………………… 8

1-3-  آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ………………………………………………… 10

1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو …………………………………………. 12

1-4-1  اثر ضد سرطانی ………………………………………………………………………. 12

1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان …………………………………. 14

1-4-2-1 آنزیم طبیعی …………………………………………………………………………. 14

1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ……………………………………………………………………… 16

1-5- فارماکوکنتیک …………………………………………………………………………… 19

1-5-1- مقاومت دارویی …………………………………………………………………….. 23

1-5-2-  تأثیر دارویی …………………………………………………………………………. 25

1-6-سمیّت ………………………………………………………………………………….. 28

فصل دوم روش کار …………………………………………………………………………. 34

2-1- مواد و میکروارگانیسم ها ……………………………………………………………….35

2-2- کشت باکتری …………………………………………………………………………… 35

2-3- اعمالUV  در زمان های مختلف ……………………………………………………. 35

2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ……… 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها….. 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها…. 38

2-5- استخراج  DNA………………………………………………………………………….

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج  DNA…………………………………………..

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)   ………………………………………………….. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………… 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………. 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………………

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………….

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll  ………….

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………….. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی ……………………………. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………… 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll …….

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز  ll………………………………….

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll  و ال-آسپاراژیناز l ………..

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-PAGE……….

 2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ……….. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ……………………………. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ………………………… 62

2-19- کشت سلول انسانی  …………………………………………………………….. 62

2-19-1- تهیه محیط كشت RPMI1640 …………………………………………….. 

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی انسانی…… 63

2-20-1- MTT Assay ………………………………………………………………

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………

فصل سوم نتایج ………………………………………………………… 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها …………………………………….. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490……

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش یافته…………. 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll  ……………………………………

3-5- تعیین توالی قطعه ژنی l-aspsraginase ll  …………………………………..

3-6- وارد کردن قطعه ژنی l-asparaginase ll  در وکتور pET23a و تأیید آن …. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد ……. 79

3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU)  ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد.. 80

3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد……. 82

3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد…… 84

\

3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی HeLa …………….

3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی LCL…………….

3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………..

فصل چهارم بحث و پیشنهادات ……………………………………………….. 98 

منابع …………………………………………………………………………………….. 108

چکیده:

ال- آسپاراژیناز آنزیمی است که موجب هیدرولیز آسپاراژین به اسید آسپاراتیک و آمونیاک می شود . نام دیگر آن ال-آسپار است . این آنزیم امروزه جهت درمان بیماری سرطان خون و برخی تومور ها استفاده می شود. بطور کلی سلولهای سرطانی قادر به سنتز اسید آمینه غیر ضروری آسپاراژین نیستند در حالی که سلولهای نرمال خودشان این اسید آمینه را می سازند لذا سلولهای سرطانی نیازمند به مقادیر بالا از آسپاراژین در حال گردش می باشند . ال- آسپاراژیناز با تجزیۀ ال-آسپاراژین مانع از دسترسی سلولهای سرطانی به منابع این اسیدآمینه می شود . مهمترین اثر جانبی این دارو حالت آلرژی یا واکنش افزایش حساسیت است . هدف ما از این تحقیق 1- تهیه پروتئین آنزیم ال-آسپاراژیناز از باکتری جهش یافته E. coli  . 2- تاثیر این پروتئین بر روی یک رده سلولی سرطانی به منظور ارزیابی فعالیت آن و 3- دستیابی به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر ، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر بوده است. لذا به منظور رسیدن به اهداف فوق مراحل آزمایشگاهی زیر انجام شد: 1- قرار دادن باکتری E. coli در معرض نور UV . 2- تخلیص  DNA و انجام PCR به منظور تکثیر ژن آنزیم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسمید  pET23a(+)  و انتقال به E. coli. 4- خالص سازی پروتئین و تعیین مقدار آن. 5-  تاثیر بر روی یک لاین سرطانی و تعیین مقدار تاثیر آن. به این ترتیب بعد از ایجاد جهش و سنجش میزان تولید و فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز در کلنی های جهش یافته و تخلیص و تکثیر ژن این آنزیم از باکتری هایی که ال-آسپار را بیش از حد معمول تولید می کردند، محصول PCR این ژن ها برای تعیین توالی ارسال گردید و پس از تعیین توالی و مطابقت با بانک ژن بین المللی ncbi ، سکانس قطعه ژنی ال-آسپاراژیناز II  از باکتری E. coli KIAU B1 به عنوان یک سکانس جدید در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1  به ثبت رسید. ژن مذکور در وکتورpET23a(+)   کلون و سپس پلاسمید نوترکیب حاصل در سلول های E. coli BL21 ترانسفر شد. . از سلول های ترانسفر شده ،پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز استخراج شد و پس از سنجش این پروتئین آنزیمی با تست های نسلریزاسیون و برادفورد، میزان فعالیت آنزیمی(IU)  و پروتئین کلّی(mg) آن مشخص و با نمونۀ استاندارد مقایسه شد. همچنین از نظر تأثیر بر سلول های سرطانی HeLa و LCL  ، با نوع استاندارد قیاس شد. نتایج نشان داد که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز نوترکیب برابر باIU/mg  178 می باشد، در حالی که فعالیت ویژه ال-آسپاراژیناز استانداردIU/mgr  77 به دست آمد. همچنین، آنزیم نوترکیب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزیمی با نوع استاندارد تفاوت  نشان می دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتری بر رده های سلولی سرطانی  HeLa و LCL  تاثیر می گذارد.

مقدمه:

با توجه به شیوع روز افزون انواع سرطان به عنوان یکی از مهمترین بیماری های تهدید کنندۀ سلامت انسان، دستیابی به روش های موثرتر در درمان سرطان به ویژه انتخاب ترکیبات دارویی با عوارض جانبی کمتر بیش از گذشته مورد توجه محققین قرار گرفته است.

آنزیم ال-آسپاراژیناز به صورت اختصاصی اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک کاتالیز کرده و نقش مهمی را در متابولیسم همه ارگانیسم های زنده و نیز در داروشناسی بازی می کند(2). دو نوع ترکیب از ال-آسپاراژیناز وجود دارد : ال-آسپاراژیناز l، یک آنزیمconstitutive  داخلی، و ال-آسپاراژیناز ll، یک آنزیم خارجی می باشد. این دو آنزیم از لحاظ بیوشیمیایی و ساختار ژنتیکی متفاوتند. ال-آسپاراژیناز ll به صورت گسترده در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی وجود دارد و بیش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). این آنزیم از منابع گوناگون مانند سلول های گیاهی و حیوانی، قارچ ها، مخمرها و باکتری ها جدا شده است(61).

ال-آسپاراژینازll  یک عامل شیمی درمانی مهم می باشد که برای درمان نوعی از اختلالات لنفوپرولیفراتیو و لنفوما، به ویژه لوکمی لنفوبلاستیک حاد یا ALL[1] بکار برده می شود. این آنزیم بخش اصلی ترکیب پروتوکل های شیمی درمانی است که در درمان ALL  اطفال به مدت تقریباً 30  سال استفاده می شود (6،5،4،3،2،1). بر این اساس، همچنین این آنزیم در جدیدترین رژیم های درمانی چند عاملی برای ALL  بالغین قرار دارد (8،7). ال-آسپاراژیناز به عنوان یک دارو، اثربخشی خود را در درمان و مراحل بعدی استراتژی های مختلف شیمی درمانی اثبات کرده است. بزرگ ترین محدودیت استفاده از ال-آسپاراژیناز حساسیت شدید بالینی در دز اثر بخشی است، که در 78-3 درصد بیماران تحت درمان با فرم های اصلاح نشده آنزیم ظاهر می شود (11،10،9،3). با گذشت بیش از 10 سال به نظر می رسد پگ-ال-آسپاراژیناز به عنوان یک ترکیب جانشین برای ال-آسپاراژیناز ، مشکلات ناشی از انواع ترکیبات طبیعی را اصلاح کرده است (13،12). در این تحقیق سعی بر این شد تا با ایجاد جهش در باکتریKIAU  E. coli ، ارزیابی میزان تولید آنزیم ال-آسپاراژینازll  در سویه جهش یافته، و دستیابی به ترتیب توالی جدید در ژن این آنزیم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژینازی استخراج کرد که از نظر فعالیت ویژه و اختصاصیت در سطح بالاتری نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنین با تاثیر این پروتئین آنزیمی بر رده سلولی سرطانی و ارزیابی فعالیت و درصد کشندگی آن بر این سلول ها، بتوان به آنزیم ال-آسپاراژیناز موثرتر، با کارایی بالا و عوارض جانبی کمتر دست یافت.

فصل اول: کلیات

1-1- پیشینه تاریخی

نظریه اولیه که به منظور گسترش ال-آسپاراژیناز به عنوان یک عامل بالقوه آنتی نئوپلاستیک ثابت شد بسیار با اهمیت بوده و توسط Clementi  در سال 1922 طرح شد(20). وی آشکار ساخت که  فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز در سرم خوکچه هندی دیده می شود. فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز فقط در سرم خوکچه هندی مشاهده می شد، درحالیکه در سایر پستانداران این آنزیم یافت نمی شد. در سال 1953، Kidd عود لنفوماهای پیوندی در موش ها و رت ها را با خوکچه هندی مقایسه کرد و شرح داد(39). این فعالیت سایتوتوکسیک در سرم اسب یا خرگوش وجود نداشت. Neuman و McCoy  در سال 1956 این نظریه ها را گسترش دادند(45). آنها ثابت کردند که رشد لاین سلولی که از کارسینوسارکومای Walker مشتق شده مستلزم ال-آسپاراژین است. Haley در سال 1961 با استفاده از لاین سلولی مربوط به لوکمی موش نتایج مشابهی بدست آورد (29). و بالاخره Broome بود که در سال 1961 درحالیکه در آزمایشگاه Kidd کار می کرد ، یافته های Kidd مربوط به مهار رشد را با اولین نظریه که توسط Clementi ارائه شد مقایسه کرد و با موفقیت نتیجه گرفت که فعالیت آنتی لنفوما در سرم های خوکچه های هندی ناشی از ال-آسپاراژیناز موجود در سرم این حیوان می باشد (12).  تحقیقات بیشتر این شخص خصوصیت نهفته درمانی این آنزیم را تایید کرد (12،11). Yellin   وWriston   در سال 1966، موفق به خالص سازی جزئی دو ایزوفرم ال-آسپاراژیناز از سرم خوکچه هندی شدند (63). بطور قابل توجه ، فقط یک ایزوفرم در شرایط in vivo  فعالیت آنتی لنفوما را آشکار می ساخت (64،63) .

از آنجاییکه استخراج این آنزیم به مقادیر کافی از سرم خوکچه هندی مشکل بود ، سایر منابع نظیر میکروبها بررسی شدند. Mashburn و Wriston ، در سال 1964  و Campbell و Mashburn در سال 1969 از خالص سازی ال-آسپاراژیناز E. coli  خبر دادند، و ثابت کردند که فعالیت تومورکشی آن شبیه به نوع سرمی خوکچه هندی می باشد(64،15).  این یافته ها پایه عملی تولید آنزیم با مقادیر زیاد را برای تحقیقات بالینی و پیش بالینی فراهم کرد(17،16،15) . Oettgen در سال 1967 اولین کسی بود که تأثیر ال-آسپاراژیناز در انسان های مبتلا به لوکمی را نشان داد (46). بطور همزمان بررسی مهم دیگری توسط Old  انجام شد که فعالیت آنتی توموری این آنزیم را در شرایط in vivo در یک مدل سگی مبتلا به لنفوسارکوما  اثبات می کرد(47).

درمان  با استفاده از پروتئین ها در انسان ها محدودیت دارد زیرا منجر به ایمنی زایی دارو می شود که مشکلی اساسی می باشد. واکنش های حساسیت شدید نسبت به ال-آسپاراژیناز E. coli  بطور متوسط عمومیت دارد. یک بررسی هم زمان بر روی ال-آسپاراژیناز E. coli و Erwinia carotovora  فقدان واکنش تقاطعی را نشان می دهد (24). هرچند هردو آنزیم به میزان زیادی  سبب تحریک سیستم  ایمنی می گردند. تلاش ها در این زمینه موجب کاهش ایمنی زایی این دارو ها شده است و این در حالیست که فعالیت آنزیمی آن حفظ شده است. مشخص شده است اتصال این آنزیم به  پلی اتیلن گلایکل یا PEG[1] به عنوان یک پردازش، واکنش های ایمنی زایی این دارو را از بین می برد بدون آنکه در ویژگی آنتی نئوپلاستیک آن تغییر ایجاد کند(27). این ترکیب اصلاح شده دارو در مدل های حیوانی باعث کاهش تشکیل آنتی بادی در مقایسه با ترکیب بومی آن می شود، و بطور محسوس مدت اثرش را طولانی می کند(57،27). در سال های اخیر، استفاده از ال-آسپاراژیناز در درمان لوکمی و سایر اختلالات لنفوپرولیفراتیو بطور وسیع افزایش یافته است. در اوایل از آن تنها برای  بهبود  بیماران مبتلا به ALL استفاده می شد (36،35،34،33،32،31،30،2،1)؛ اما پس از  تحقیقات اخیر به منظور تقویت درمان بدخیمی های لنفوئید، عملکرد این آنزیم را به مدت 30-20 هفته تجویز می گردد(57) . به این دلایل است که ال-آسپاراژیناز به عنوان یک جزء ضروری در روش های نوین شیمی درمانی چند دارویی قرار گرفته است.